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체지방감소

동물실험법

제목 PGC-1α 유전자 발현 측정
구분 체지방감소 링크 에너지소비 증가
실험배경
Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-alpha (PGC-1a)는 전사조절도움인자 (transcriptional coactivator)로써 갈색지방조직에서 PPAR gamma의 기능을 상승시키는 역할을 하는 것으로 처음 밝혀졌다. 그 이후에 미토콘드리아가 다량 함유된 근육조직 등에서 skeletal muscle fiber type의 전환, 당수송 및 지질대사를 조절함으로써 에너지 대사를 조절하는 것으로 알려졌다. 특히 운동중에 나타나는skeletal muscle fiber type의 변환 (type 2에서 type 1으로의 변환) 및 갈색지방조직에서의 열발생 및 AMPK 발현증가의 현상은 PGC-1a의 활성과 transcription을 증가시키는 것으로 보고되어, 조직중의 PGC1a의 발현정도를 측정하는 것은 에너지 소비증가에 따른 기능성 소재의 체지방감소효과를 밝히는 중요한 요소가 될 수 있다
실험재료
필요장비 및 소모품
Pipette, RNA용 pipet tip, RNA용 EP tube, Autoclave, real time PCR, 분광광도계, 저울, 핀셋, 조직균질기(또는 막자사발), 96 well plate(PCR용), vortex, 원심분리기
 
필요시약
RNase Wiper, Trizol reagent(또는 RNA extraction kit), RNase-free water, reverse transcriptase, 10X RT buffer, Oligo dT primer, dNTP mix, PGC-1a forward primer, PGC-1a reverse primer, ethanol, PCR master mix (SYBR green 또는 Taqman), 액체질소, 클로르포름, 이소프로판올
 
세포주

 

 
실험방법
1. 조직에서 total RNA를 Trizol reagent(또는 RNA extract kit)을 이용하여 추출하고, 순도 및 함량을 확인한다. [SOP A13111. RNA 추출 및 cDNA 합성] 참조
2. 샘플별로 추출한 RNA 함량을 동일하게 맞춘다.
3. 추출한 RNA, oligo(DT) primer, dNTP, reverse transcriptase, RT buffer. RNase inhibitor, RNase free water를 이용하여 cDNA를 합성한다. [SOP A13111. RNA 추출 및 cDNA 합성] 참조
4. 실험동물의 종에 맞도록 PGC-1α primer를 제작한다.
5. PCR 튜브에 합성한 cDNA, PGC-1α forward primer, PGC-1α reverse primer, SYBR Green PCR Master mix(또는 Taqman)를 첨가한다.
6. 제작된 primer에 맞도록 반응온도와 cycle을 조절하여 quantitative RT-PCR을 실시한다
7. 2△△CT방법을 사용하여 PGC-1α 유전자의 발현양을 정량한다. 이때 endogenous control 유전자로 normalization한다. [SOP A13112 Quantitative Real Time PCR] 참조
결과해석
 항비만 소재에 의해 PGC-1a mRNA 발현이 증가되면 에너지 대사에 영향을 미칠 것으로 판단할 수 있다
참고문헌 1. Kang C, Ji LL, Role of PGC-1a signaling in skeletal muscle health and disease, Ann N Y Acad Sci, 1271() p110-117, 2012
2. Wu Z, Puigserver P, Andersson U, Zhang C, Adelmant G, Mootha V, Troy A, Cinti S, Lowell B, Scarpulla RC, Spiegelman BM., Mechanisms controlling mitochondrial biogenesis and respiration through the thermogenic coactivator PGC-1, Cell, 9() p115-124, 1999
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제목 PGC-1α 유전자 발현 측정 링크 에너지소비 증가
실험재료
필요장비 및 소모품
Pipette(Eppendorf), RNA용 pipet tip(Eppendorf), RNA용 EP tube(QSP), Autoclave(Daeil engineering), real time PCR(Applied Biosystems), 분광광도계(Jasco), 저울(Satorious), 핀셋(덕산종합과학), 조직균질기(MP Bio), PCR용 96 well plate(Applied Biosystems), vortex(Ika works), 원심분리기(Eppendorf)
 
필요시약
RNase Wiper(iNtron), RNA extraction kit(MN), Oligo dT primer RT Premix Kit(cDNA PreMix Kit, iNtron), RNase-free water(GIBCO), PGC-1α forward primer(Macrogen), PGC-1α reverse primer(Macrogen), ethanol(Sigma), PCR master mix(TOYOBO)
 
실험방법
1. RNA 추출
1) 실험동물에서 근육을 적출한다.
2) 근육 30mg과 bead를 멸균한 tube에 넣고 RNA extract kit (MN)의 RA1(3.5 μl β-ercaptoethanol 포함)을 350 ul 넣은 뒤, MP homogenize 기계를 이용하여 균질화한다(6 m/s, 40).
3) 균질화된 조직으로부터 RNA extract kit (MN)을 이용하여 total RNA를 분리한다.
4) Nanodrop을 이용하여 추출한 RNA의 순도 및 농도를 확인(μg/μl)한다.
5) 다음 실험 전까지 -80 ℃에 보관한다.
Tips:
- 상세한 방법은 [SOP A13111 RNA 추출 및 cDNA합성] 실험예를 참조한다.
- 260/280 ratio가 1.8~2.1 사이인지 확인한다.
- Base가 증류수이기 때문에 blank를 RNA free 증류수로 잡는다.
2. cDNA 합성
1) RNA 정량을 바탕으로 total reaction에서의 template RNA 양을 정한다.
2) Oligo dT primer, reverse transcriptase가 들어있는 tube(cDNA PreMix Kit, iNtron)에 추출한 RNA를 넣는다.
Template RNA: 0.1~1 μg
RNA free water: Up to 20 μl
Total reaction volume: 20 μl
3) PCR cycler를 이용하여 cDNA를 합성한다.
- cDNA synthesis, 45 ℃, 60분
- RTase inactivation, 95 ℃, 5분
4) cDNA 합성이 다 끝난 후 원심분리하여 용액을 모은 후 다음 실험 전까지 -20℃에서 보관한다.
Tips:
- TaqMan assay를 이용할 경우, PGC-1α에 대한 probe를 이용하여 cDNA를 합성한다.
3. qRT-PCR
1) cDNA (2 μl), 10 μM forward primer (1 μl), 10 μM reverse primer (1 μl), 2X SYBR Green PCR Master mix (10 μl), RNase-free water (6 μl)를 1.5 ml tube에 넣어 혼합한다.
PGC-1α forward primer: 5’-TGG AGT GAC ATA GAG TGT GCT GC-3’
PGC-1α reverse primer: 5’-CTC AAA TAT GTT CGC AGG CTC A-3’
β-Actin forward primer: 5’-AATACCCCAGCCATGTGTGT-3’
β-Actin reverse primer: 5’-ATGGGCACTGTGTGTGACC-3’
Tips:
- 혼합액을 만들 때 삼반복을 위해 3배수 이상의 양을 한 tube에 만든다.
- Normalization을 위해 endogenous control 유전자로 β-Actin을 이용할 수 있다.
- 각 샘플마다 primer를 넣어준 PGC-1α PCR 혼합 tube와 β-Actin primer를 넣어준 PCR 혼합 tube를 만든다.
- Primer sequence는 primer3 등의 web-based primer design 소프트웨어를 이용해서 제작할 수 있다.
2) Real time PCR 전용 plate에 ①에서 혼합한 용액을 넣는다.
3) Real time PCR에 넣고 반응시간에 따라 qRT-PCR를 실시한다.
4) PCR의 조건은 다음과 같다.
- Incubation: 95℃ 10분
- Amplication: 95℃ 20초, 60℃ 15초, 72℃ 30초 조건으로 총 45 cycles
- Melting curve: 95℃ 15초, 60℃ 1분, 60~95℃에서 0.3℃씩(1초), 95℃ 15초
5) PCR이 끝나고 난 뒤 PGC-1α Ct값을 β-Actin Ct값으로 normalization 한 후, PGC-1α 발현양을 확인한다.
Tips:
- 상세한 방법은 [SOP A13112 Quantitative Real Time PCR] 실험예를 참조한다.
실험결과 예
결과해석
고지방식이군에 비하여 항비만 기능성소재 식이군의 PGC-1a mRNA 발현이 증가한 것은 기능성소재에 의한 에너지 대사의 변화에 영향을 준 것으로 판단된다.
참고문헌
첨부파일
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