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체지방감소

시험관내 및 세포실험법

제목 Hepa 1-6 세포배양
구분 체지방감소 링크 기초실험법
실험배경
Hepa 1-6 세포는 마우스 유래 간암세포주로서 간장질환과 관련된 대사성 질환 모델로 많이 사용된다. 이와 관련된 대사성 질환 중 하나인 비알콜성 지방간(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 가장 일반적인 간질환으로 중성지질함량이 전체 간 무게의 5%를 초과하는 것으로 정의된다. 비만이나 인슐린비의존형 당뇨병 유발시 많이 나타나게 된다. 따라서, 기능성 소재의 효능평가시 비만으로 인해 간으로 유입되는 지방산의 합성 억제 또는 지방 산화 촉진을 통한 항비만 효과를 Hepa 1-6 세포주 모델로 확인할 수 있다.
실험재료
필요장비 및 소모품
도립현미경(Inverted microscope), 무균작업대(Clean bench), 항온수조(Water bath), 원심분리기, 액체질소탱크, Cryotube, 배양 플라스크(T25/T75), 세포배양기(CO2 incubator), 6 well plate, 1회용 pipette(10 ml), pipette, pipette tip, cell counter
 
필요시약
Dulbecco’s Modified Eagles Medium(DMEM), fetal bovine serum, insulin, sodium pyruvate, tryphan blue, penicillin/streptomycin, 0.5% trypsin-EDTA, phosphate buffered saline(PBS), Dimethyl sulfoxide (DMSO)
 
세포주
Hepa 1-6 cell 
실험방법
1. Hepa 1-6 cell이 배양 플라스크 면적의 70~80% 정도 차지하면 계대배양을 한다.
2. 먼저, 배지를 제거하고 PBS로 washing 해준다.
3. Trypsin 처리하여 세포를 뗀 후, 배지를 첨가한다.
4. 세포를 tube에 모아 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 새 배지를 첨가한다.
5. 세포현탁액을 배지와 적정 비율로 섞어 배양 플레이크에 넣고, 골고루 잘 퍼지도록 한다.
6. 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양한다.
결과해석
참고문헌 1. Kleiner DE, Brunt EM, Van Natta M, Behling C, Contos MJ, Cummings OW, et al., Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease, Hepatology, 41() p1313-1321, 2005
2. Angulo P., Nonalcoholic fatty liver disease., N Engl J Med, 346() p1221-1231, 2002
3. Moscatiello S, Manini R, Marchesini G., Diabetes and liver disease: an ominous association., Nutr Metab Cardiovasc Dis, 17() p63-70, 2007
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제목 Hepa 1-6 세포배양 링크 기초실험법
실험재료
필요장비 및 소모품
도립현미경(Olympus), 무균작업대(수공테크), 항온수조(대일화학), 원심분리기(Sorvall fresco), 액체질소탱크(Cryogenics), Cryotube(Nunc), 배양 플라스크(T25/T75, SPL), 세포배양기(Thermo scientific), 6 well plate(BD falcon), 1회용 pipette(10 ml, BD falcon), pipette(Thermo scientific), pipette tip(QSP), cell counter(Invitrogen)
 
필요시약
DMEM(Gibco), fetal bovine serum(Gibco), tryphan blue(Gibco), penicillin/streptomycin(Gibco), 0.5% Trypsin-EDTA(Gibco), PBS(Sigma), DMSO(Sigma)
 
실험방법
1. 배지 제조
10% FBS/DMEM

2. 동결세포 해동 및 배양
1) 액체질소 탱크에 보관된 Hepa 1-6 세포를 꺼내어, 곧바로 37℃ 항온수조기에 넣고 녹인다.
Tips:
- 항온수조기의 온도를 미리 37℃로 셋팅한다.
- 배지도 미리 데워둔다.
2) Vial속 배지가 거의 녹았을 때, 항온수조기에서 꺼내어 70% 에탄올로 소독하고 무균작업대로 신속하게 옮긴다.
3) 배지에 세포를 풀고, 1000 rpm에서 3분간 원심분리한다.
4) 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 다시 배지를 넣어 single cell로 만든다.
5) 배지 5 ml를 넣은 배양 플라스크(T25)에 세포현탁액을 넣은 다음, 세포가 고르게 퍼질 수 있도록 잘 섞어준다.
6) 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 배양한다.
7) Hepa 1-6 세포가 배양 플라스크 면적의 70~80%정도 차지하면 계대배양한다.
8) 먼저, 배지를 버리고 PBS로 washing한다.
9) PBS를 버리고 0.05% trypsin-EDTA 1ml를 처리하여 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 3분간 방치한다.
10) 세포가 잘 떨어졌는지 확인하고 미리 데워둔 배지를 첨가한다.
Tips:
- FBS가 들어있는 배지를 처리하는 것은 trypsin 반응을 중지시키기 위함이다.
11) 세포현탁액을 tube에 모아 1000 rpm에서 3분간 원심분리한다.
12) 원심분리 후에, 상층액을 제거하고 배지를 넣어 세포를 풀어준다.
13) 배지 10 ml를 넣은 배양 플라스크(T75)에 세포현탁액을 넣고, 세포가 고르게 퍼질 수 있도록 섞어준다.
14) 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 배양한다.
실험결과 예
1. 현미경 사진 (200배)
 
2. 현미경 사진 (400배)

결과해석
Hepa 1-6 세포가 고르게 잘 퍼져 단층(monolayer)을 잘 이루는 것을 확인할 수 있다.
참고문헌
첨부파일
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