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체지방감소

시험관내 및 세포실험법

제목 지방세포 분화 측정(Oil red O 염색법)
구분 체지방감소 링크 지방세포 분화 억제
실험배경
에너지 이용과 식이 섭취의 불균형으로 인해 지방전구세포의 지방세포로의 분화에 관여하는 유전자의 발현이 증가한다. 또는 분화된 지방세포에 축적된 지방은 혈중 또는 간에서의 지질 함량을 증가시킨다.
Oil red O 염색법은 지방세포에 축적된 지방구를 염색하는 실험법으로 염료가 용매보다 지질에 상대적으로 잘 용해되어 지질에 착색되는 용해도의 차이를 이용한 방법이다. 지방구가 붉은색으로 염색된다. 
실험재료
필요장비 및 소모품
도립현미경(Inverted microscope), 분광광도계, 무균작업대(Clean bench), 항온수조(Water bath), 원심분리기, 세포배양용 플레이트(T75), 세포배양기(CO2 incubator), 6 well plate, 1회용 pipette(10 ml), pipette, pipette tip, cell counter, 주사기용 필터 
 
필요시약
Dulbecco’s Modified Eagles Medium(DMEM), calf serum, fetal bovine serum, methylisobutylxanthine, dexamethasone, insulin, sodium pyruvate, tryphan blue, penicillin/streptomycin/glutamine, 0.5% trypsin-EDTA, phosphate buffered saline(PBS), Oil-Red O(ORO), formalin, isopropyl alcohol  
 
세포주
3T3-L1 fibroblast 
실험방법
1. 3T3-L1 fibroblast가 배양 플라스크 면적의 70~80% 정도 차지하면 계대배양한다. [SOP A11230. 3T3-L1 Fibroblast 세포배양 및 분화] 참조
2. 먼저, 배지를 제거하고 PBS로 washing한다.
3. 0.05% trypsin-EDTA 처리하여 세포를 뗀 후, 배지로 중화시킨다.
4. 세포를 tube에 모아 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 새 배지를 넣어 세포를 풀어준다
5. 세포수를 측정한다.
6. 일정 농도로 세포수를 맞춘 다음, 6-well plate에 분주한다.
7. 세포가 부착되면, 배지를 교환해 주고 2~3일 더 배양한다.
8. Metylisobutylxanthine, insulin, dexamethasone이 함유된 10% FBS/DMEM 분화용 배지로 교환하여 2일 더 배양한다.
9. Insulin이 함유된 10% FBS/DMEM으로 교환한 뒤, 2일간 더 배양한다.
10. 10% FBS/DMEM으로 교환한 뒤, 세포내에 지방이 차는 것이 관찰될때까지 배양한다.
11. 분화가 종료되면, 각 well의 배지를 버리고 10% formaldehyde 용액을 넣고 1시간 동안 고정시킨다.
12. Isoprophyl alcohol에 녹인 Oil-red O(ORO) solution을 넣고, 10분 정도 염색한 후 물로 헹궈낸다.
13. 현미경으로  관찰하고, 염색된 ORO를 isopropanol로 녹여내어 500 nm에서 흡광도를 측정한다.
결과해석
1. 현미경을 통한 세포 형태 관찰
분화된 지방세포의 경우 현미경을 통해 세포내에 축적된 지방구를 관찰할 수 있으며 지방축적이 적을 수록 분화가 억제된 것으로 판단한다.
2. 염색된 ORO 용출을 통한 세포내 지방 축적 측정
ORO 염색을 통해 붉게 염색된 oil red o를 isopropyl alcohol로 녹여내어 ORO 용출 정도를 통해 세포내 지방 축적 정도를 측정한다. 분광광도계로 측정시 OD값이 높을수록, 분화가 많이 된 것으로 판단한다.
참고문헌 1. Ahn J, Lee H, Kim S, Park J, Ha T, The anti-obesity effect of quercetin is mediated by the AMPK and MAPK signaling pathways, Biochem. Biophys. Res. Commun., 373(4) p545-549, 2008
2. Gao Y, Zhou Y, Xu A, Wu D, Effects of an AMP-Activated Protein Kinase Inhibitor,Compound C, on Adipogenic Differentation of 3T3-L1 cells, Biol. Pharm. Bull., 31(9) p1716-1722, 2008
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제목 지방세포 분화 측정(Oil red O 염색법) 링크 지방세포 분화 억제
실험재료
필요장비 및 소모품
도립현미경(Olympus), 분광광도계(Jasco), 무균작업대(수공테크), 항온수조(대일화학), 원심분리기(Sorvall fresco), 세포배양용 플레이트(T75, SPL), 세포배양기(Thermo scientific), 6 well plate(BD falcon), 1회용 pipette(10 ml, BD falcon), pipette(Thermo scientific), pipette tip(QSP), cell counter(Invitrogen), 주사기용 필터(0.2 μm, ADVANTEC) 
 
필요시약
DMEM(Gibco), calf serum(Gibco), fetal bovine serum(Gibco), methylisobutylxanthine(Sigma), dexamethasone(Sigma), insulin(Sigma), sodium pyruvate(Gibco), tryphan blue(Gibco), penicillin/streptomycin/glutamin(Gibco), 0.5% Trypsin-EDTA(Gibco), PBS(Sigma), Oil-red O(Sigma), isopropyl alcohol(Sigma), formalin(Sigma) 
 
실험방법
1. 세포 배양 및 분화 유도
* 세포배양에 관한 상세한 내용은 [SOP A11230 3T3-L1 fibroblast 세포배양 및 분화] 실험예를 참고한다.
* 세포 배양시에는 10% FBS/DMEM 증식용 배지를 사용한다.
1) 3T3-L1 fibroblast가 배양 플라스크 면적의 70~80% 정도 자라면 0.05% trypsin-EDTA 처리하여 세포를 뗀 후, 배지를 첨가한다.
2) 세포현탁액을 1,000 rpm, 3분 동안 원심분리한 다음, 상층액을 제거하고 새 배지를 넣어 세포를 풀어준다.
3) 세포수를 측정한 후, 6 well plate에 well 당 5 × 105 cells 이 되도록 분주한다.
4) 세포가 부착되면 배지를 교환해 주고, 꽉 찰때까지 배양한다.
5) Methylisobutylxanthine, insulin, dexamethasone이 함유된 10% FBS/DMEM 분화용 배지로 교환하여 2일 더 배양한다(Day 0).
Tips:
- 세포의 형태가 둥글게 변화되는 것을 관찰할 수 있다.
- fresh한 상태의 methylisobutylxanthine, insulin, dexamethasone을 사용하는 것이 분화를 잘 유도할 수 있다. 따라서, 실험시마다 새로이 만들어 사용한다.
6) 1 μg/ml Insulin이 함유된 10% FBS/DMEM 배지로 교환하여 2일 더 배양한다(Day 2).
Tips:
- Insulin이 함유된 배지로 교환한 뒤부터, 세포내에 지방구가 차는 것을 관찰할 수 있다.
7) 10% FBS/DMEM 배지에로 교환하여, 2일 더 배양한다(Day 4).
8) 7)과정을 반복한다(Day 6).
9) 2~3일 후에 완전히 분화된 지방세포를 관찰할 수 있다(Day 8~9).
Tips :
- 분화 여부를 확인하기 위해 현미경 관찰뿐만 아니라, Oil-Red O 염색을 통해서도 확인한다.
 
2. Oil-Red O 염색
1) 분화가 종료되면, well에 담긴 배지를 버리고, 10% formalin을 1ml씩 넣고 5분간 둔다.
2) 10% formalin를 버린 뒤, 다시 10% formalin을 각 well에 1ml씩 넣고 1시간 고정시킨다.
Tips :
- 1시간 이상 10% formalin에 두어야 세포가 잘 고정된다.
3) 1시간이 지난 뒤, 각 well에 담긴 10% formalin을 버리고, 60% isopropyl alcohol을 2ml씩 넣고 washing한다.
4) 60% isopropyl alcohol를 버리고 건조시킨다.
Tips :
- 공기로 건조시키거나 후드안에서 말리면 잘 건조된다.
5) 준비해둔 Oil-Red O(ORO) Working Solution을 각 well당 1ml 씩 넣고 10분간 둔다.
Tips :
- ORO stock: 0.7g Oil Red O + 200ml isopropyl alcohol, 4℃ 보관
- ORO Working Solution: ORO와 물을 6:4(ORO: DW)의 비율로 섞은 뒤, 상온에서 20분간 방치 시킨다. 주사기용 필터(0.2 μm pore)를 사용하여 필터한다.
6) ORO Working Solution을 버리고 물로 4번 씻어 준다.
7) 물이 있는 상태에서 현미경으로 관찰하고 사진을 찍는다.
8) 물을 버리고 건조시킨다.
Tips:
- 물을 완전히 제거시켜야 잘 건조된다.
9) 염색 된 세포를 plate상태로 사진 찍는다.
10) 100% Isopropyl alcohol 1ml을 넣어 염색된 ORO를 용출시킨다.
Tips :
- Isopropyl alcohol이 공기중에 쉽게 날아가므로 재빨리 한다.
11) 이것을 96well plate에 300ul씩 나누어 담는다.
12) 490nm에서 흡광도를 측정한다.
실험결과 예

 

1. 현미경 관찰사진 

 o 좋은 효과를 보인 시료의 예

 o 별다른 효과를 보이지 않은 예

 

 

2. Oil-red O 추출 

 o 좋은 효과를 보인 시료의 예

 o 별다른 효과를 보이지 않은 예

  

 

 

결과해석
1. 현미경 관찰 결과
ORO 염색 후 세포 내 붉게 염색된 것은 지방구로서 붉은 부분이 많을수록 분화가 잘 된 세포이다. 
2. ORO 용출의 분광광도계 측정 결과
100% Isopropyl alcohol로 세포내 침착된 Oil-red O를 녹여 내어 흡광도를 측정한 결과는 흡광도가 높을 수록 세포내 축적된 지방의 양이 많음을 의미한다.
참고문헌
첨부파일
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