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체지방감소

시험관내 및 세포실험법

제목 3T3-L1 fibroblast 에서 GPDH 활성 측정
구분 체지방감소 링크 지방합성 억제
실험배경
비만은 에너지 섭취와 소비의 불균형에 의해 유발되며 이 때 지방세포의 비대, 전지방세포로부터의 분화 등이 유도된다. 즉 세포 분화가 활발할수록 지방세포 내의 지방축적이 증가하여 비만 상태가 된다. 지방 축적에 관여하는 효소 중 하나인 Glycerol-3-phosphate dehydrogenase(GPDH)는 지방세포로 분화가 진행될수록 발현이 증가하며, 세포 내 지방 축적에 관여하는 것으로 알려져 있다. 후보 물질을 지방전구 세포주인 3T3-L1에 처리한 후 지방세포로 분화 및 축적에의 관여를 측정하고자 한다.
실험재료
필요장비 및 소모품
효소면역분석기, 세포배양용 플레이트, 세포배양기, 초음파 분해기, 원심분리기
 
필요시약
Glycerol-3-phosphate-dehydrogenase(GPDH) Assay Kit 
세포주
3T3-L1 fibroblast 
실험방법
1. 세포배양
1) 3T3-L1 fibroblast를 10% bovine serum을 포함한 DMEM 배지로 키운다.
2) 75% 정도 세포가 자라면 trypsin 처리로 세포를 모은 후, 6 well plate에 2.5 x 105/mL 으로 well 당 2 mL씩 분주한다.
3) 세포가 well에 꽉 차게 자란 뒤 2-3일 간 더 배양한다.
4) 10% FBS를 포함한 DMEM 배지에 0.5 mM IBMX, 1 μg/ml insulin, 1 μM dexamethasone을 넣은 분화 유도 배지를 만들어 48시간 동안 처리한다. 이 때 시험 물질을 같이 투여해 준다.
5) 1 μg/ml insulin 만을 포함한 10% FBS를 포함한 DMEM 배지로 교환한 후 48시간 배양한다.
6) 10% FBS를 포함한 DMEM 배지로 2일 간격으로 배지를 교환하면서 세포 내에 지방이 축적되는 것이 관찰될 때까지 6-9일간 더 배양한다.
 
2. GPDH assay
1) GPDH 기질이 담긴 병에 11 ml의 1차 증류수를 넣은 뒤 15 초간 vortexing하여 GPDH 기질을 용해시킨다
2) Enzyme 추출 완충용액을 실온에서 해동시킨 후 희석용 완충용액을 실온에서 해동시킨 후 실험 전에 2-ME를 최종 농도 1 mM로 첨가한다
3) 세포를 얼음물 온도로 냉각된 PBS로 두 번 세척한 뒤 well당 200 μl의 enzyme 추출 완충용액을 첨가하고 즉시 희석용 완충용액을 동량 첨가한다.
4) 원심분리기로 4℃ 조건에서 13,000 g 로 5분 동안 원심분리한 뒤 상청액을 얻어 실험 sample로 한다.
5) 96 well plate에 100 μl씩 GPDH 기질 요액을 넣은 뒤 25 μl의 sample을 넣고 Elisa reader에서 340 nm 에서의 흡광도의 1분간의 차이를 측정한다. 
결과해석
Glycerol-3-phosphate Dehydrogenase 활성은 지방전구세포가 분화되어 성숙한 지방세포가 되었을때 급격히 증가한다. DHAP(dihydroxyacetone phosphate) 와 NADH가 샘플(세포 lysate)에서 추출한 GPDH와 같이 있으면 glycerol-3-phosphate 와 NAD가 생성된다. NADH 농도가 감소할수록 분화가 억제 된 것으로 판단한다. 
참고문헌 1. Kubota H, Morii R, Kojima-Yuasa A, Huang X, Yano Y, Matsui-Yuasa I, Effect of Zizyphus jujuba Extract on the Inhibition of Adipogenesis in 3T3-L1 Preadipocytes, Am. J. Chin. Med., 37(3) p597–608, 2009
2. Pinent M, Bladé MC, Salvadó MJ, Arola L, Hackl H, Quackenbush J, Trajanoski Z, Ardévol A, Grape-seed derived procyanidins interfere with adipogenesis of 3T3-L1 cells at the onset of differentiation, Int. J. Obes., 29(8) p934–941, 2005
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제목 3T3-L1 fibroblast 에서 GPDH 활성 측정 링크 지방합성 억제
실험재료
필요장비 및 소모품
ELISA reader(ELASA system), 96 well Culture plate(SPL LIFE SCINCES), Sonicator(SONICS), Centrifuge(HANIL SCIENCE INDUSTRIAL)
 
필요시약
Glycerol-3-phosphate-dehydrogenase (GPDH) Assay Kit(TAKARA)
 
실험방법
1. 세포 배양
1) 3T3-L1 fibroblast를 10% bovine serum을 포함한 DMEM 배지로 키운다.
2) 75% 정도 세포가 자라면 trypsin 처리로 세포를 모은 후, 6 well plate에 2.5 x 105/mL 으로 well 당 2 mL 씩 분주한다.
3) 세포가 well에 꽉차게 자란 뒤 2-3일 간 더 배양한다.
Tips :
- 세포가 well에 가득 차지 않은 상태에서 분화를 유도하면 분화가 잘 안됨!
4) 10% FBS를 포함한 DMEM 배지에 0.5 mM IBMX, 1 μg/ml insulin, 1 μM dexamethasone을 넣은 분화 유도 배지를 만들어 48시간 동안 처리한다. 이 때 시험 물질을 같이 투여해 준다.
Tips :
- 계대수가 높은 세포를 사용할 경우, well 가장자리의 세포가 박리되어 떨어질 수 있음.
5) 1 μg/ml insulin 만을 포함한 10% FBS를 포함한 DMEM 배지로 교환한 후 48시간 배양한다.
6) 10% FBS를 포함한 DMEM 배지로 2일 간격으로 배지를 교환하면서 세포 내에 지방이 축적되는 것이 관찰되는 시점까지 6-9일간 더 배양한다.
 
2. GPDH assay 
1) GPDH 기질이 담긴 병에 11 ml의 1차 증류수를 넣은 뒤 15 초간 vortexing하여 GPDH 기질을 용해시킨다.
Tips :
- 이 용액을 4℃에 보관하면 2 주간 - 80℃에서 보관하면 약 한 달간 안정함
2) Enzyme 추출 완충용액을 실온에서 해동시킨 후 희석용 완충용액을 실온에서 해동시킨 후 실험 전에 2-ME를 최종 농도 1 mM로 첨가한다.
Tips :
- 2-ME는 14.4 M의 농도로 판매되기 때문에 5 μl의 5-ME를 715 μl의 증류수에 용해시켜 0.1 M로 제조한 뒤 이를 다시 100배 희석하여 사용함.
3) 세포를 얼음물 온도로 냉각된 PBS로 두 번 세척한 뒤 well당 200 μl의 Enzyme 추출 완충용액을 첨가하고 즉시 희석용 완충용액을 동량 첨가한다.
4) 원심분리기로 4℃ 조건에서 13,000 g 로 5분 동안 원심분리한 뒤 상청액을 얻어 실험 sample로 한다.
Tips :
- sample은 희석용 완충용액으로 2 fold로 연속적으로 희석해서 예비실험하여 실제 실험에서는 결과가 가장 잘나오는 농도로 실험한다.
5) 96 well plate에 100 μl씩 GPDH 기질 요액을 넣은 뒤 25 μl의 sample을 넣고 Elisa reader에서 340 nm 에서의 흡광도의 1분간의 차이를 측정한다.
Tips:
- 일반적으로 sample을 넣은 뒤 2-10 분 뒤에 반응을 완료된다.
6) GPDH activity는 다음 공식에 따라 산출된다.

 
실험결과 예
 

결과해석
세포에 후보 물질을 처리한 날짜가 지남에 따라 GPDH의 활성이 점차 감소함을 확인할 수 있었다. 후보 물질이 분화억제 효능이 있는 것으로 판단되어 진다.
참고문헌 1. Kubota H, Morii R, Kojima-Yuasa A, Huang X, Yano Y, Matsui-Yuasa I, Effect of Zizyphus jujuba Extract on the Inhibition of Adipogenesis in 3T3-L1 Preadipocytes, Am. J. Chin. Med., 37(3) p597–608, 2009
2. Pinent M, Bladé MC, Salvadó MJ, Arola L, Hackl H, Quackenbush J, Trajanoski Z, Ardévol A, Grape-seed derived procyanidins interfere with adipogenesis of 3T3-L1 cells at the onset of differentiation, Int. J. Obes., 29(8) p934–941, 2005
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