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체지방감소

시험관내 및 세포실험법

제목 3T3-L1 fibroblast 에서 PPARγ 단백질 발현 측정
구분 체지방감소 링크 지방세포 분화 억제
실험배경
비만은 에너지 섭취와 소비의 불균형에 의해 유발되며 이 때 지방세포의 비대, 전지방세포로부터의 분화 등이 유도된다. 즉 세포 분화가 활발할수록 지방세포 내의 지방축적이 증가하여 비만 상태가 된다. 후보 물질의 항비만 효능 평가를 위한 방법으로 후보 물질을 마우스 지방전구 세포주인 3T3-L1 fibroblast에 처리하여 분화 억제 활성을 측정한다. 후보 물질을 세포에 처리한 후 세포 분화가 억제될수록 지방세포 분화 억제를 통한 항비만 효과가 증가함을 알 수 있다.
지방전구세포에서 지방세포로 분화되는 과정에서 PPARγ, C/EBPα 같은 전사인자들은 지방세포 특화 단백질들인 glucose transporter(GLUT4)나 adipocyte-specific fatty acid binding protein2(aP2)의 연속적인 발현에 관계된다. 이 단백질들의 발현은 지방세포들이 glucose나 지방산을 흡수하여 지방을 합성하거나 축적하게 되어 지방세포의 크기가 커지게 된다.
실험재료
필요장비 및 소모품
Immun-Blot PVDF Membrane, 원심분리기
 
필요시약
Ripa buffer(10X), Non-fat dry milk, Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X), ECL plus detection kit, PPARγ antibody
 
세포주
3T3-L1 fibroblast 
실험방법
1. 3T3-L1 fibroblast를 10% bovine serum을 포함하는 DMEM 배지 (증식용 배지)를 사용하여 배양한 후 플레이트에 적절한 세포수로 배양한다.
2. 10% FBS를 포함한 DMEM (분화용 배지) 플레이트에 세포가 빈틈없이 자란 후 2-3일간 더 배양한다.
3. 세포를 분화 유도 물질인 insulin (5 μg/mL), dexamethasone (0.25 μM), 3-Isobutyl-1-methylxanthine (0.5 mM)을 포함한 배지로 교환한 후 2-3일간 배양한다.
4. 세포를 insulin (5 μg/mL)만 포함한 배지로 교환한 후 2-3일간 배양 후 10% FBS/DMEM 로 교환한 후 세포내에 지방이 축적되는 시점까지 6-8일간 더 배양한다.
5. 항비만 효과 물질은 분화 유도 전 또는 분화 유도 후 실험 목적에 따라 처리한다.
6. 세포들을 얼음물 온도로 냉각된 PBS로 두 번 세척한 뒤, scrapper로 RIPA 완충용액(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% (v/v) Nonidet-p40, 0.5% (w/v) sodium deoxycholate, 0.1% (w/v) SDS, 1 mM Na3VO4, 10 μg/ml leupeptin, 50 mM NaF, 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoride로 구성)으로 얻은 후 얼음에서 냉각되어 1시간 동안 lysis 한다.
7. 원심분리기로 18,000 g로 4℃조건에서 20분간 원심분리한 후, 상청액의 단백질 양을 정량한 후 30 ug의 단백질을 SDS-polyacrylamide gel로 전기영동하여 분리하고 poly vinylidene difluoride 막으로 transfer(이동) 시킨다.
8. 막을 TBST(10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.06% Tween-20)에 용해된 5% (w/v) 건조 skim mik(건조 무지방 우유)로 30분간 block한 후 5 % (w/v) 무지방 건조 우유를 포함하는 TBST에서 1시간동안 PPARγ 일차 항체와 배양한다.
9. Blot을 2.5% (w/v) 무지방 건조 우유를 포함하는 TBST에서 30 분간 horseradish peroxidase-conjugated 2차 항체로 처리한다.
10. ECL plus detection kit로 immune complex(면역반응이 일어난 복합체)를 측정한다.
결과해석
ECL plus detection kit로 처리한 후 X-ray film에 현상한 후 후보물질 농도별로 western band를 비교한다. Band가 짙을수록 유전자 발현이 증가되었다는 것을 의미한다.
PPARγ 같은 전사인자의 발현의 수준을 Western blot을 이용해 Band가 옅을 수록 지방세포 분화 억제가 된 것으로 판단한다. 
참고문헌 1. Furuyashiki T, Nagayasu H, Aoki Y, Bessho H, Hashimoto T, Kanazawa K, Ashida H, Tea Cathechin Suppresses Adipocyte Differentiation Accompanied by Down-regulation of PPARγ2 and C/EBPα in 3T3-L1 cells, Biosci. Biotechnol. Biochem., 68(11) p2353-2359, 2004
2. Xiao Y, Yuan T, Yao W, Liao K, 3T3-L1 adipocyte apoptosis induced by thiazolidinediones is peroxisome proliferator-activated receptor-gamma-dependent and mediated by the caspase-3-dependent apoptotic pathway, FEBS J., 277(3) p687–696, 2010
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제목 3T3-L1 fibroblast 에서 PPARγ 단백질 발현 측정 링크 지방세포 분화 억제
실험재료
필요장비 및 소모품
Immuno-Blot PVDF Membrane, Centrifuge
 
필요시약
Ripa buffer(10X), Non-fat dry milk, Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X), ECL plus detection kit, PPARγ 1st antibody
 
실험방법
1. 세포 배양
1) 3T3-L1 fibroblast를 10% bovine serum을 포함한 DMEM 배지로 키운다.
2) 75% 정도 세포가 자라면 trypsin 처리로 세포를 모은 후, 6 well plate에 2.5 x 105/mL 으로 well 당 2 mL 씩 분주한다.
3) 세포가 well에 꽉차게 자란 뒤 2-3일 간 더 배양한다.
4) 10% FBS를 포함한 DMEM 배지에 0.5 mM IBMX, 1 μg/ml insulin, 1 μM dexamethasone을 넣은 분화 유도 배지를 만들어 48시간 동안 처리한다. 이 때 시험 물질을 같이 투여해 준다.
5) 1 μg/ml insulin 만을 포함한 10% FBS를 포함한 DMEM 배지로 교환한 후 48시간 배양한다.
6) 10% FBS를 포함한 DMEM 배지로 2일 간격으로 배지를 교환하면서 세포내에 지방이 축적되는 시점까지 6-9일간 더 배양한다.
 
2. Western Blot
1) 세포들을 얼음물 온도로 냉각된 PBS로 두 번 세척한 뒤, Plate를 얼음 위에 올려놓은 뒤 RIPA 완충용액(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 % (v/v) Nonidet-p40, 0.5 % (w/v) sodium deoxycholate, 0.1 % (w/v) SDS, 1 mM Na3VO4, 10 ug/ml leupeptin, 50 mM NaF, 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoride로 구성)을 6 well plate의 1 well당 200 ㎕씩 넣는다.
2) scrapper를 이용하여 세포가 떨어지도록 긁어준 후 EP-tube에 담아 얼음물 상태에서 30분 동안 sonication해준다.
3) 원심분리기로 18,000 g로 4 ℃조건에서 20분간 원심분리한 후, 상청액을 ep-tube에 담아 protein assay를 하여 정량한 후 모든 sample의 protein을 동일하게 lysis buffer를 이용하여 맞춰준 후 실험 전까지 -80 ℃에 보관해둔다.
4) 실험하기 위해 -80 ℃에 보관해 두었던 sample을 얼음에 꽂아 놓고 녹인다. 4X sample buffer (250 mM Tris-HCl (pH 6.8), 40% glycerol, 8% SDS, 4% β-mercaptoethanol, 0.2% bromophenol blue)를 sample에 함께 섞은 후 끓는 물에서 5분간 끓여 준다.
5) 30 ug의 단백질을 만들어 놓은 SDS-polyacrylamide gel (1.5 M Tris-HCl (pH 8.0), DDW, 30% acrylamide, 10% SDS, TEMED, 10% APS)에 loading한 후 10% SDS PAGE buffer (Tris base, glycine, SDS)를 이용하여 120 V에서 protein을 분리해준다.
6) 전기영동이 끝나면 gel의 protein을 Transfer buffer (Tris base, glycine, SDS, methyl alcohol)를 이용하여 PVDF membrane으로 옮겨준다.
7) Transfer된 membrane을 납작한 통에 옮겨 TBST (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.06 % Tween-20)에 용해된 5 % (w/v) 건조 skim mik(건조 무지방 우유)에 용해된 5% skim milk를 부어 상온에서 1시간동안 Orbital shaker를 사용한 shaking상태에서 blocking을 실시한다.
8) Blocking이 끝나면 skim milk를 버리고 membrane에 남아있는 skim milk는 TBST로 한두 번 살짝 세척해준다.
9) PPARγ 1차 항체를 5% BSA에 희석한다.
10) 희석한 1차 항체를 납작한 통에 membrane이 잠길 정도로 부어준 후 냉장상태에서 over night shaking해 준 후 PBS를 이용하여 5분씩 1시간 동안 세척해준다.
11) PPARγ 1차 항체와 동일한 Host의 horseradish peroxidase-
conjugated 2차 항체를 5% skim milk에 희석한 후 희석한 2차 항체를 membrane이 잠길 정도로 부어준 후 상온에서 1~2시간 shaking해 준다.
12) PBS를 이용하여 10분 간격으로 3번 washing하여 1시간 동안 세척해준다.
13) ECL plus detection kit로 immune complex(면역반응이 일어난 복합체)를 측정한다. 
실험결과 예

출처 : Furuyashiki T et al., 2004
결과해석
0, 10, 30 uM 농도의 후보 물질을 처리한 결과 PPARγ의 Western blot결과가 농도의존적으로 유의하게 감소함을 보여 후보 물질이 지방세포 분화 억제 효능이 있음을 알 수 있다.
참고문헌 1. Furuyashiki T, Nagayasu H, Aoki Y, Bessho H, Hashimoto T, Kanazawa K, Ashida H, Tea Cathechin Suppresses Adipocyte Differentiation Accompanied by Down-regulation of PPARγ2 and C/EBPα in 3T3-L1 cells, Biosci. Biotechnol. Biochem., 68(11) p2353-2359, 2004
2. Xiao Y, Yuan T, Yao W, Liao K, 3T3-L1 adipocyte apoptosis induced by thiazolidinediones is peroxisome proliferator-activated receptor-gamma-dependent and mediated by the caspase-3-dependent apoptotic pathway, FEBS J., 277(3) p687–696, 2010
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