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체지방감소

시험관내 및 세포실험법

제목 지방세포 사멸(apoptosis) 측정(LSC assay)
구분 체지방감소 링크 지방세포 사멸 유도
실험배경
세포사멸 (Apoptosis)은 세포 주기에 있어서 필연적인 세포사인 과정으로 염색체 응축, 세포막 파괴, 핵 붕괴, apoptotic 세포체의 형성 및 분해로 특징되어 진다. 지방전구세포 및 일반 정상 조직세포에 영향을 끼치지 않으면서 지방세포에만 apoptosis를 일으키는 경우 비만에 효과적인 치료법이 될 수 있으며 apoptosis 기전에 의한 항비만 효능을 검색할 수 있다.
Apoptosis를 측정하기 위해 AV/PI 공염색 방법을 사용한다. AV는 apoptosis의 특징인 세포막에서 외부화된 phosphatidylserine을 측정하고, PI는 근접 세포막을 통해 투과할 수 없으나 중기나 후기 apoptosis에서 세포막의 기능이 손상되었을 때 핵을 염색할 수 있다. LSC 시스템이 시간에 따라 AV/PI 강도를 측정하면서 초기로부터 후기 apoptosis로의 세포수의 관련 변화에 대한 정보를 제공할 수 있다.
실험재료
필요장비 및 소모품
레이저 스캐닝 세포분석기, 도립 현미경, 세포배양용 플레이트 
 
필요시약
Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC) Apoptosis Detection Kit propidium iodide, binding buffer(BD Biosciences), DMSO 
 
세포주
mouse fibroblast 3T3-L1, 3T3-L1 adipocyte, Rat 부고환 지방  
실험방법
1. 세포배양
1) 마우스 3T3-L1 세포를 10% bovine serum을 포함한 DMEM 배지로 키운다.
2) 75% 정도 세포가 자라면 trypsin 처리로 세포를 모은 후, 6 well plate에 2.5 x 105/mL 으로 well 당 2 mL씩 분주한다.
3) 세포가 well에 꽉 차게 자란 뒤 2-3일 간 더 배양한다.
4) 10% FBS를 포함한 DMEM 배지에 0.5 mM IBMX, 1 μg/ml insulin, 1 μM dexamethasone을 넣은 분화 유도 배지를 만들어 48시간 동안 처리한다. 이 때 시험 물질을 같이 투여해 준다.
5) 1 μg/ml insulin 만을 포함한 10% FBS를 포함한 DMEM 배지로 교환한 후 48시간 배양한다.
6) 10% FBS를 포함한 DMEM 배지로 2일 간격으로 배지를 교환하면서 6-9일간 더 배양한다 (세포 내에 지방이 축적되는 시점까지).
 
2. LSC 방법 
1) 성숙한 지방세포들에 적당한 농도의 시료를 처리한 시료군과 1000배 희석 DMSO 처리군(대조군)으로 나눈다.
2) 각 군의 단층 세포들을 차가운 PBS로 2번, binding buffer(결합 완충액)로 한 번 세척한 후 100 μl의 결합 완충액 안에서 5 μl의 annexin V-fluorescein isothiocyanate (AV)와 5 μl의 propidium iodide (PI)와 함께 어두운 실온 조건에서 부드럽게 교반하면서 15분간 배양한 뒤 400 μl의 결합 완충액을 첨가한다.
3) 슬라이드를 현미경 관측대에 위치시키고 아르곤 레이저로 488 nm로 발광시킨 후 20 관찰 렌즈를 통해 순차적으로 스캔한다.
4) 세포에서 방출된 형광은 녹색과(AV/FITC 또는 TUNEL/Alexa-Fluor) 장파장의 적색 필터(PI)를 통해 수집된다.
5) 형광의 최대 픽셀 값으로 나타나는 형광 강도로 나타내는 세포수 데이터는 구분과 형태 변화를 위한 WinCyte 와 CompuSort software로 분석된다.
6) 사용자-정의 관심분위의 스캔 과정은 끝나기 까지 약 30 분정도 시간이 소요되며 5000 번의 수집완료시 자동적으로 멈추어진다.
결과해석
x축은 PI 최대 PIXEL로 하고 Y축은 AV 최대 PIXEL로 하여, AV 강도가 높을수록, PI 강도가 낮을수록 apoptosis가 증가하여 항비만 효능이 있다고 판단할 수 있다.
참고문헌 1. Lin J, Page KA, Della-Fera MA, Baile CA, Evaluation of adipocyte apoptosis by laser scanning cytometry, Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord., 28(12) p1535–1540, 2004
2. Bacso Z, Eliason JF, Measurement of DNA damage associated with apoptosis by laser scanning cytometry, Cytometry, 45(12) p180–186, 2001
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제목 지방세포 사멸(apoptosis) 측정(LSC assay) 링크 지방세포 사멸 유도
실험재료
필요장비 및 소모품
Laser scanning cytometry, Inverted microscope, 6 well Culture plate
 
필요시약
Dimetyl Sulfoxide(DMSO), Propidium iodide (287075, Sigma),  
Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC) Apoptosis Detection Kit (APOAF, Sigma),  
Binding buffer (556454, BD Biosciences)
 
실험방법
1. 세포 배양- 3T3-L1 fibroblast
1) 3T3-L1 fibroblast를 10% bovine serum을 포함한 DMEM 배지로 키운다.
2) 75% 정도 세포가 자라면 trypsin 처리로 세포를 모은 후, 6 well plate에 2.5 x 105/mL 으로 well 당 2 mL 씩 분주한다.
3) 세포가 well에 꽉차게 자란 뒤 2-3일 간 더 배양한다.
4) 10% FBS를 포함한 DMEM 배지에 0.5 mM IBMX, 1 μg/ml insulin, 1 μM dexamethasone을 넣은 분화 유도 배지를 만들어 48시간 동안 처리한다. 이 때 시험 물질을 같이 투여해 준다.
5) 1 μg/ml insulin 만을 포함한 10% FBS를 포함한 DMEM 배지로 교환한 후 48시간 배양한다.
6) 10% FBS를 포함한 DMEM 배지로 2일 간격으로 배지를 교환하면서 6-9일간 더 배양한다 (세포내에 지방이 축적되는 것이 관찰되는 시점까지).
 
2. 세포 배양- Rat 부고환 지방 세포
1) High calorie high fat diet(60% fat)로 비만을 유도한 수컷 SD rat을 경추탈골 시킨다.
2) 경추탈골 시킨 동물의 겉을 포타딘이나 70% 알코올로 잘 소독시켜 clean bench안으로 옮긴다.
3) 화염 멸균된 가위로 동물을 개복한다.
4) 부고환에 연결된 지방을 분리하여 가위로 1~2 mm 정도로 잘게 자른다.
5) 멸균된 bottle 에 잘게 자른 지방과 Krebs-Ringer Hepes buffer (pH 7.4)를 넣고 37% 에서 1 시간 동안 shaking 해준다.
6) buffer 위 층에 지방띠가 생긴다. 긴 파스퇴르 pipet을 이용하여 지방띠 밑에 있는 buffer 를 제거해준다.
7) Bottle 안에 새로운 buffer를 넣어준 후 250 uM filter 를 씌운 주사기를 멸균 tube 에 받쳐 filter 해준다.
8) 500~600 rpm으로 5분간 centrifuge한다.
9) 밑에 가라앉은 혈관 등은 버리고 위에 뜬 지방 세포 한방울 (10 μl)을 hemotocytometer 에 떨어뜨린 후 그것을 뒤집어 cell 을 counting 한다.
10) 6 well plat에 5×104 cells/well로 분주한다.
 
3. LSC 방법
1) 성숙한 지방세포들에 적당한 농도의 시료를 처리한 시료군과 1000배 희석 DMSO 처리군(대조군)으로 나눈다.
2) Annexin V-FITC, Propidium Iodide는 한 실험당 5 U당 사용하며 4℃에 보관한다. 10X Annexin V 결합 완충용액 30 ml을 270 ml의 증류수로 희석해서 사용한다.
3) 각 군의 단층 세포들을 차가운 PBS로 2번, binding buffer(결합 완충액)로 한 번 세척한 후 1X 결합완충용액 1 ml에 1×106 세포를 suspension 시킨 후에 100 ul의 결합 완충액을 5ml 배양 tube에 넣고 세포 1×105에서 5 μl의 annexin V-fluorescein isothiocyanate (AV)와 5 μl의 propidium iodide (PI)와 를 첨가한다
4) 어두운 실온 조건에서 부드럽게 vortex 하면서 15분간 배양한다.
5) 400 ul의 결합 완충용액을 각 배양 tube에 넣고 1시간 이내에 Laser scanning cytometry를 이용해 분석한다.
6) 슬라이드를 현미경 관측대에 위치시키고 아르곤 레이저로 488 nm로 발광시킨 후 20 관찰 렌즈를 통해 순차적으로 스캔한다.
7) 세포에서 방출된 형광액 녹색과(AV/FITC 또는 TUNEL/Alexa-Fluor) 장파장의 적색 필터(PI)를 통해 수집된다.
8) 형광의 최대 픽셀 값으로 나타나는 형광 강도로 나타내는 세포수 데이터는 구분과 형태 변화를 위한 WinCyte 와 CompuSort software로 분석된다.
9) 사용자-정의 관심분위의 스캔 과정은 끝나기 까지 약 30 분정도 시간이 소요되며 5000 번의 수집완료시 자동적으로 멈추어진다. 
실험결과 예


결과해석
x축은 PI 최대 PIXEL로 하고 Y축은 AV 최대 PIXEL로 하여 AV,PI 강도가 모두 낮은 구역은 세포 생존을 의미하며, 높은 AV 강도, 낮은 PI 강도 구역은 apoptosis상태이며, 높은 PI 강도 구역은 죽은 세포를 의미한다. 각 구역의 세포수의 백분율을 계산하여 apoptosis 세포의 진행상황을 볼 수 있다. 이를 정량 하였을때 초기 apoptosis, 후기 apoptosis로 분류하여 정량할 수 있고, 후보 물질 A를 50, 100, 200 uM 처리하였을 때 처리에 따라 apoptosis가 증가한 것을 볼 수 있다.
 
참고문헌 1. Lin J, Page KA, Della-Fera MA, Baile CA, Evaluation of adipocyte apoptosis by laser scanning cytometry, Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord., 28(12) p1535–1540, 2004
2. Bacso Z, Eliason JF, Measurement of DNA damage associated with apoptosis by laser scanning cytometry, Cytometry, 45(12) p180–186, 2001
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