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체지방감소

시험관내 및 세포실험법

제목 지방세포 사멸(apoptosis) 측정(TUNEL assay)
구분 체지방감소 링크 지방세포 사멸 유도
실험배경
세포사멸 (Apoptosis)은 세포 주기에 있어서 필연적인 세포사인 과정으로 염색체 응축, 세포막 파괴, 핵 붕괴, apoptotic 세포체의 형성 및 분해로 특징되어 진다. 지방전구세포 및 일반 정상 조직세포에 영향을 끼치지 않으면서 지방세포에만 apoptosis를 일으키는 경우 비만에 효과적인 치료법이 될 수 있으며 apoptosis 기전에 의한 항비만 효능을 검색할 수 있다.
TUNEL 분석법은 apoptosis 신호들의 일련의 반응에 의해 수반된 DNA 절편화를 탐지하는 일반적인 방법이다. 이 분석법은 DNA에 지표물질로 이차적으로 표지된 dUTP들을 첨가하는 반응을 촉매하는 효소인 terminal deoxynucleotidyl transferase에 의해 규명될 수 있는 nick들이 존재한다는 점에 기반한다. 이 분석법은 심각한 DNA 손상을 받은 세포들을 표지할 수 있다.
실험재료
필요장비 및 소모품
형광 현미경 , 세포배양용 플레이트  
필요시약
APO-BrdU TUNEL kit, Dimethylsulfoxide(DMSO), Diphenylmethane-4,4-diisocyanate 
세포주
mouse fibroblast 3T3-L1, 3T3-L1 adipocyte, Rat 부고환 지방 세포
 
실험방법
1. 세포배양
1) 3T3-L1 fibroblast를 10% bovine serum을 포함한 DMEM 배지로 키운다.
2) 75% 정도 세포가 자라면 trypsin 처리로 세포를 모은 후, 6 well plate에 2.5 x 105/mL 으로 well 당 2 mL씩 분주한다.
3) 세포가 well에 꽉 차게 자란 뒤 2-3일 간 더 배양한다.
4) 10% FBS를 포함한 DMEM 배지에 0.5 mM IBMX, 1 μg/ml insulin, 1 μM dexamethasone을 넣은 분화 유도 배지를 만들어 48시간 동안 처리한다. 이 때 시험 물질을 같이 투여해 준다.
5) 1 μg/ml insulin 만을 포함한 10% FBS를 포함한 DMEM 배지로 교환한 후 48시간 배양한다.
6) 10% FBS를 포함한 DMEM 배지로 2일 간격으로 배지를 교환하면서 6-9일간 더 배양한다(세포 내에 지방이 축적되는 것이 관찰되는 시점까지).
 
2. TUNEL 분석법
1) 지방전구세포와 성숙한 지방세포들을 적당한 농도의 시료 또는 1000배 희석한 DMSO와 함께 24시간 동안 배양한다.
2) 이에 덧붙여서 TUNEL 분석(Day 6) 6일 전에 시료처리와 동시에 지방생성을 유도하기 위해 diphenylmethane-4,4-diisocyanate를 처리한다.
3) 세포들을 0.5 ml PBS에 담은 뒤 1%(w/v) paraformaldehyde가 포함된 5 ml PBS에 첨가하고 얼음 위에서 15분간 방치한다.
6) 300 g에서 5분간 원심분리 한 후 상층액을 제거하고 5 ml의 PBS로 300g에서 5분간 2번 세포 pellet을 세척해 준다.
7) 얼음물 온도로 냉각된 70% 에탄올 5 ml에 세포를 suspension한 후 -20°C freezer에서 24시간 동안 보관한다.
9) 300 g에서 5 분간 원심분리 한 후 aspiration 방법을 이용해 70% 에탄올을 제거하고 ep-tube를 사용해 1ml의 세척 완충용액에 재현탁한 후 300 g에서 5 분간 원심분리 한 후 aspiration 방법을 이용해 상층액을 제거한다. 한 번 더 반복한다.
10) 세포 Pellet들을 50 μl DNA-labelling 용액에 재현탁 한 후, 37℃에서 1시간 동안 배양한다
11) 1 ml의 세척(Rinse) 완충용액 을 첨가하고 원심분리 한 후 aspiration 방법을 이용해 상층액을 제거한다.
12) 세포 pellet이 담긴 Ep-tube에 항체 염색 용액 100ul를 첨가하고 실온에서 차광하여 30분간 배양한다
13) 0.5 ml의 propidium iodide/RNase A staining buffer을 각 sample에 첨가한 후 30 분간 추가 방치한 뒤 형광 현미경으로 관찰한다.
결과해석
형광 현미경으로 400배 확대 관찰했을 때, 정상군은 PI에 의한 일반적인 핵 염색만을 보이며 TUNEL 신호를 보이지 않는다. 후보 물질 처리에 의해 밝게 응축된 핵 염색을 보일 시에는 apoptosis에 의한 DNA 절편화가 나타났다고 해석한다. 
참고문헌 1. Lin J, Page KA, Della-Fera MA, Baile CA, Evaluation of adipocyte apoptosis by laser scanning cytometry, Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord., 28(12) p1535–1540, 2004
2. Lin J, Della-Fera MA, Baile CA, Green tea polyphenol epigallocatechin gallate inhibits adipogenesis and induces apoptosis in 3T3-L1adipocytes, Obes. Res., 13() p982–990, 2005
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제목 지방세포 사멸(apoptosis) 측정(TUNEL assay) 링크 지방세포 사멸 유도
실험재료
필요장비 및 소모품
Fluorescent microscope, 6 well Culture plate
 
필요시약
APO-BrdU TUNEL Kit (A23210, Invitrogen),  Dimethyl Sulfoxide (DMSO),
Diphenylmethane-4,4-diisocyanate (442658-U, Sigma)
 
실험방법
1. 세포 배양- 3T3-L1 fibroblast
1) 3T3-L1 fibroblast를 10% bovine serum을 포함한 DMEM 배지로 키운다.
2) 75% 정도 세포가 자라면 trypsin 처리로 세포를 모은 후, 6 well plate에 2.5 x 105/mL 으로 well 당 2 mL 씩 분주한다.
3) 세포가 well에 꽉차게 자란 뒤 2-3일 간 더 배양한다.
Tips :
- 세포가 well에 가득 차지 않은 상태에서 분화를 유도하면 분화가 잘 안됨!
4) 10% FBS를 포함한 DMEM 배지에 0.5 mM IBMX, 1 μg/ml insulin, 1 μM dexamethasone을 넣은 분화 유도 배지를 만들어 48시간 동안 처리한다. 이 때 시험 물질을 같이 투여해 준다.
Tips :
-계대수가 높은 세포를 사용할 경우, well 가장자리의 세포가 박리되어 떨어질 수 있음.
5) 1 μg/ml insulin 만을 포함한 10% FBS를 포함한 DMEM 배지로 교환한 후 48시간 배양한다.
6) 10% FBS를 포함한 DMEM 배지로 2일 간격으로 배지를 교환하면서 6-9일간 더 배양한다 (세포내에 지방이 축적되는 것이 관찰되는 시점까지).
 
2. 세포 배양- Rat 부고환 지방 세포
1) High calorie high fat diet(60% fat)로 비만을 유도한 수컷 SD rat을 경추탈골 시킨다.
2) 경추탈골 시킨 동물의 겉을 포타딘이나 70% 알코올로 잘 소독시켜 clean bench안으로 옮긴다.
3) 화염 멸균된 가위로 동물을 개복한다.
4) 부고환에 연결된 지방을 분리하여 가위로 1~2 mm 정도로 잘게 자른다.
5) 멸균된 bottle 에 잘게 자른 지방과 Krebs-Ringer Hepes buffer (pH 7.4)를 넣고 37% 에서 1 시간 동안 shaking 해준다.
6) Buffer 위 층에 지방띠가 생긴다. 긴 파스퇴르 pipet을 이용하여 지방띠 밑에 있는 buffer 를 제거해준다.
7) Bottle 안에 새로운 buffer를 넣어준 후 250 μM filter 를 씌운 주사기를 멸균 tube 에 받쳐 filter 해준다.
8) 500~600 rpm으로 5분간 centrifuge한다. 
9) 밑에 가라앉은 혈관 등은 버리고 위에 뜬 지방 세포 한방울 (10 ㎕)을 hemotocytometer 에 떨어뜨린 후 그것을 뒤집어 cell 을 counting 한다.
10) 6 well plat에 5×104 cells/well로 분주한다.
 
3. TUNEL 분석법
1) DNA-labelling 용액을 준비한다.
Tips :
- 한 sample당 50 μl씩 필요
각 50 ul당 10 μl의 반응 용액(Tip:초록색 Cap), 0.75 μl의 TdT 효소(Tip:노란색 Cap), 8.0 μl의 BrdUTP(Tip:보라색 Cap)과 31.25 μl의 증류수를 넣는다.
Tips :
- 필요 산출양+10% 정도의 여유분으로 제조하며, 24 시간 동안 안정하다.
2) 항체 염색 용액을 준비한다.
5.0 μl의 Alexa Fluor 488 dye–labeled anti .BrdU antibody(주황색 Cap)을 95 μl의 세척(Rinse) 완충용액(빨간색 Cap)에 섞은 후 vortexing하여 준비한다.
Tips :
- 필요 산출량+10%의 여유분으로 준비한다.
3) 지방전구세포와 성숙한 지방세포들을 적당한 농도의 시료 또는 1000배 희석한 DMSO와 함께 24시간 동안 배양한다.
4) 이에 덧붙여서 TUNEL 분석(Day 6) 6일 전에 시료처리와 동시에 지방생성을 유도하기 위해 diphenylmethane-4,4-diisocyanate를 처리한다.
5) 2~3×106 세포들을 0.5 ml PBS에 담은 뒤 1%(w/v) paraformaldehyde가 포함된 5 ml PBS에 첨가하고 얼음 위에서 15분간 방치한다.
6) 300 g에서 5분간 원심 분리한 후 상층액을 제거하고 5 ml의 PBS로 300g에서 5분간 2번 세포 pellet을 세척해 준다.
7) 얼음물 온도로 냉각된 70% 에탄올 5 ml에 세포를 suspension한 후 -20°C freezer에서 24시간 동안 보관한다.
Tips :
- 최소 30분 이상 보관하여야 하고 수 일 간은 안정하다.
9) 300 g에서 5 분간 원심분리 한 후 aspiration 방법을 이용해 70% 에탄올을 제거하고 ep-tube를 사용해 1ml의 세척 완충용액(파란색 Cap)에 재현탁한 후 300 g에서 5 분간 원심분리 한 후 aspiration 방법을 이용해 상층액을 제거한다. 한 번 더 반복한다.
10) 세포 Pellet들을 50 μl DNA-labelling 용액에 재현탁 한 후, 37℃에서 1시간 동안 배양한다.
Tips :
- 15분 마다 흔들어 주는데 이는 세포가 계속 현탁되게 유지해주기 위해서다.
11) 1 ml의 세척(Rinse) 완충용액 (빨간색 Cap)을 첨가하고 300 g에서 5 분간 원심분리 한 후 aspiration 방법을 이용해 상층액을 제거한다.
12) 세포 pellet이 담긴 ep-tube에 항체 염색 용액 100 μl를 첨가하고 실온에서 차광하여 30분간 배양한다.
Tips :
- 차광을 하지 않으면 DNA-labelling이 광분해 되어 결과가 잘 안 나온다.
13) 0.5 ml의 propidium iodide/RNase A staining buffe를 각 sample에 첨가한 후 30 분간 추가 방치한 뒤 형광 현미경으로 관찰한다.
Tips :
- 방치 시 차광하여야 한다. 
실험결과 예

결과해석
(A)는 DMSO 처리군으로 일반 핵의 PI염색만이 관찰되고 TUNEL이 나타나지 않고 (B)는 200 uM의 후보 물질을 지방생성과정의 6일 동안 처리한 군으로 핵의 밝게 응축된 부분을 보여, apoptotic 상태를 나타내고 (C)는 200 μM의 후보 물질을 지방전구 세포에 24 시간 동안 처리한 군으로 TUNEL 양성 염색이 나타나지 않았고 (D)는 200 μM의 후보 물질을  분화된 성숙한 지방세포에 24 시간 동안 처리한 군으로 TUNEL 염색이 나타난다. 따라서 후보 물질은 분화된 성숙한 지방세포에 apoptosis를 유발하는 효능이 있으며, 지방세포 선택적 세포 사멸을 경우 항비만에 효과가 있을 것으로 판단된다. 
참고문헌 1. Lin J, Page KA, Della-Fera MA, Baile CA, Evaluation of adipocyte apoptosis by laser scanning cytometry, Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord., 28(12) p1535–1540, 2004
2. Lin J, Della-Fera MA, Baile CA, Green tea polyphenol epigallocatechin gallate inhibits adipogenesis and induces apoptosis in 3T3-L1adipocytes, Obes. Res., 13() p982–990, 2005
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