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체지방감소

시험관내 및 세포실험법

제목 3T3-L1 fibroblast 세포 배양액에서 glycerol 함량 측정
구분 체지방감소 링크 지방분해 증가
실험배경
지방분해가 일어나면 중성지질 (triglyceride)이 분해되면서 glycerol이 방출되므로 세포배양 배지 중의 glycerol 농도가 높아진다. Glycerol은 glycerol kinase에 의해 glycerol-1-phosphate 이 되고 glycerol phosphate oxidase에 의해 산화되어 dihydroxyacetone phosphate (DAP)와 hydrogen peroxide (H2O2)를 생성한다. . Peroxidase는 H2O2 를 4-aminoantipyrine (4-AAP) 와 sodium N-ethyl-N-(3-sulfopropyl) m-anisidine (ESPA)과 반응시켜 quinoneimine을 생성하는데 이것을 570 nm에서 흡광도를 측정한다. 
실험재료
필요장비 및 소모품
효소면역측정기, 세포배양용 플레이트, 항온수조  
필요시약
Free glycerol Assay Kit , DMSO 
세포주
3T3-L1 fibroblast, 3T3-L1 adipocyte
 
실험방법
1. 3T3-L1 fibroblast를 10% bovine serum을 포함하는 DMEM 배지 (증식용 배지)를 사용하여 배양한 후 플레이트에 적절한 세포수로 배양한다.
2. 10% FBS를 포함한 DMEM (분화용 배지) 플레이트에 세포가 빈틈없이 자란 후 2-3일간 더 배양한다.
3. 세포를 분화 유도 물질인 insulin (5 μg/mL), dexamethasone (0.25 μM), 3-Isobutyl-1-methylxanthine (0.5 mM)을 포함한 배지로 교환한 후 2-3일간 배양한다.
4. 세포를 insulin (5 μg/mL)만 포함한 배지로 교환한 후 2-3일간 배양 후 10% FBS/DMEM 로 교환한 후 6-8일간 더 배양한다 (세포 내에 지방이 차는 것이 관찰되는 시점까지).
5. 항비만 효과 물질은 분화 유도 전 또는 분화 유도 후 실험 목적에 따라 처리한다.
6. 세포 배양 배지를 10000 rpm, 10분간 원심 분리하여 상청액을 파스퇴르 피펫으로 얻는다.
7. Plate에서 옮겨서 얻은 후에 65 ℃에서 8분간 가열하여 세포들에서 방출된 효소들을 불활성화 시킨다.
8. 실험 전에 glycerol probe를 220 μl DMSO에, Glycerol Enzyme Mix를 Assay buffer(분석용 완충용액)에 용해시킨 후 차광하여 -20 ℃에 실험 전까지 보관한다.
9. 10 μl의 glycerol 표준용액을 990 μl의 분석용 완충용액으로 희석하여 1 mM glycerol 표준용액을 만든 뒤, 잘 섞은 후 각 well에 0, 2, 4, 6, 8, 10 μl 씩 가한 후 각 well에 분석용 완충용액을 추가하여 50 μl로 맞춰준다.
10. Sample(효소를 불활성화 시킨 배지)를 각 well에 50 μl씩 가한다.
11. 각 well당 46 μl의 분석용 완충용액, 2 μl의 glycerol probe, 2 μl의 Glycerol Enzyme Mix를 포함하는 총 50 μl의 Reaction Mix(반응 혼합액)를 준비한다.
12. 표준용액과 sample을 포함하는 well에 반응 혼합액을 50 μl씩 가하고 잘 섞어준 후 차광하여 실온에서 30분간 방치한다.
13. 570 nm에서 흡광도를 측정한다. 
결과해석
후보 물질에 의해 지방분해가 항진된 경우 지방세포내 축적되어 있던 중성지질의 량은 감소하고 glycerol 방출양은 증가하게 되기 때문에 glycerol 방출량이 증가 하는 것은 그만큼 중성지질이 분해되었다는 것을 의미하며 후보 물질이 항비만 효능이 있음을 알 수 있다. 
참고문헌 1. Lee MS, Kim CT, Kim IH, Kim Y, Inhibitory Effects of Green Tea Catechin on the Lipid Accumulation in 3T3-L1 Adipocytes, Phytother. Res., 23(8) p1088-1091, 2009
2. Mochizuki M, Hasegawa N, Effects of Green Tea Catechin-induced Lipolysis on Cytosol Glycerol Content in Differentiated 3T3-L1 Cells, Phytother. Res., 18() p945-946, 2004
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제목 3T3-L1 fibroblast 세포 배양액에서 glycerol 함량 측정 링크 지방분해 증가
실험재료
필요장비 및 소모품
ELISA reader, 96 well Culture plate, Water bath
 
필요시약
Free glycerol assay Kit (K630-100, BioVision), Dimethyl Sulfoxide (DMSO)
 
실험방법
1. 세포 배양
1) 3T3-L1 fibroblast를 10% bovine serum을 포함한 DMEM 배지로 키운다.
2) 75% 정도 세포가 자라면 trypsin 처리로 세포를 모은 후, 6 well plate에 2.5 x 10 5승 cells/mL 으로 well 당 2 mL 씩 분주한다.
3) 세포가 well에 꽉차게 자란 뒤 2-3일 간 더 배양한다.
Tips :
- 세포가 well에 가득 차지 않은 상태에서 분화를 유도하면 분화가 잘 안됨!
4) 10% FBS를 포함한 DMEM 배지에 0.5 mM IBMX, 1 μg/ml insulin, 1 μM dexamethasone을 넣은 분화 유도 배지를 만들어 48시간 동안 처리한다. 이 때 시험 물질을 같이 투여해 준다.
Tips :
- 계대수가 높은 세포를 사용할 경우, well 가장자리의 세포가 박리되어 떨어질 수 있음.
5) 1 μg/ml insulin 만을 포함한 10% FBS를 포함한 DMEM 배지로 교환한 후 48시간 배양한다.
6) 10% FBS를 포함한 DMEM 배지로 2일 간격으로 배지를 교환하면서 6-9일간 더 배양한다 (세포 내에 지방이 축적되는 것이 관찰되는 시점까지).
 
2. Free glycerol 측정 방법
1) 세포 배양 배지를 plate에서 옮겨서 얻은 후에 항온수조에서 65℃에서 8분간 가열하여 세포들에서 방출된 효소들을 불활성화 시킨다.
2) 실험 전에 glycerol probe를 220 μl DMSO에, Glycerol Enzyme Mix를 Assay buffer(분석용 완충용액)에 용해시킨 후 차광하여 -20℃에 실험 전까지 보관하고 실험 전에 상온에 꺼내어 준비한다.
Tips :
- glycerol probe, Glycerol Enzyme Mix는 작은 vial에 포함되어 있으므로 aliquot 전에 반드시 짧은 centrifuge/or Spin down시킨 후에 용해시키는 것이 좋다.
3) 10 μl의 glycerol 표준용액을 990 μl의 분석용 완충용액으로 희석하여 1 mM glycerol 표준용액을 만든 뒤, 잘 섞은 후 각 well에 0, 2, 4, 6, 8, 10 μl 씩 가한 후 각 well에 분석용 완충용액을 추가하여 50 μl로 맞춰준다.
Tips :
- 취하는 양이 소량이라 정확한 양을 취하기가 어려워 standard curve가 잘나타나지 않는 경우가 있으므로 pippetting 시 천천히 수번 반복하여 정확한 양을 취하도록 해야하며 standard를 duplicate하는 것이 중요하다.
4) Sample(효소를 불활성화 시킨 배지)를 각 well에 50 μl씩 가한다.
Tips :
- sample은 미리 예비실험을 하여 검량선내의 흡광도를 나타내는 농도로 희석하여 실험하여야 한다.
5) 각 well당 46 μl의 분석용 완충용액, 2 μl의 glycerol probe, 2 μl의 Glycerol Enzyme Mix를 포함하는 총 50 μl의 Reaction Mix(반응 혼합액)를 준비한다.
Tips :
-거품이 생기는 경우 용량을 정확히 정량하기 어렵고 반응이 정상적으로 일어나지 않으므로 잘 섞어서 거품을 제거한 후에 사용한다.
6) 표준용액과 sample을 포함하는 well에 반응 혼합액을 50 μl씩 가하고 잘 섞어준 후 차광하여 실온에서 30분간 방치한다.
Tips :
- 차광을 하지 않으면 광분해로 인해 정색반응이 제대로 나타나지 않을 수 있으므로 반드시 차광봉투 등을 이용해 차광하여야 한다.
7) ELISA reader로 570 nm에서 흡광도를 측정한다.
8) 검량선에 따라 Glycerol의 농도를 계산하고 희석배수를 곱해서 sample의 glycerol농도를 산출한다.
실험결과 예
 
출처 : Lee MS et al., 2009
결과해석
10 μM의 후보 물질 처리에 따라 세포배양 배지 중으로 방출되는 glycerol의 량이 유의하게 증가한 것을 관찰할 수 이었다. 후보 물질이 지방세포의 지방분해를 촉진시키는 효과가 있음을 알 수 있다.
참고문헌 1. Lee MS, Kim CT, Kim IH, Kim Y, Inhibitory Effects of Green Tea Catechin on the Lipid Accumulation in 3T3-L1 Adipocytes, Phytother. Res., 23(8) p1088-1091, 2009
2. Mochizuki M, Hasegawa N, Effects of Green Tea Catechin-induced Lipolysis on Cytosol Glycerol Content in Differentiated 3T3-L1 Cells, Phytother. Res., 18() p945-946, 2004
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