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체지방감소

시험관내 및 세포실험법

제목 지방세포에서 CPT-1 유전자 발현 측정
구분 체지방감소 링크 지방분해 증가
실험배경
Carnitine palmitoyltransferase 1 (CPT-1)은 미토콘드리아 외막에 존재하는 효소로서 미코톤드라아 막 외부의 긴 사슬 지방산을 carnitine을 이용하여 막 안으로 수송하는 역할을 한다. CPT-1의 발현이 증가되면 긴 사슬 지방산의 미토콘드리아 내막으로의 수송이 늘어나 β-산화가 촉진되어 항비만 효능이 있는 것으로 판단한다.
실험재료
필요장비 및 소모품
Real time QPCR System, DNAse-free water
 
필요시약
TRI reagentⓡ, AMV 역전사 효소 
세포주
3T3-L1 fibroblast, 3T3-L1 adipocyte, Rat 부고환 지방세포
 
실험방법
1. 3T3-L1 fibroblast 를 10% bovine calf serum (BCS) 을 포함하는 DMEM 배지를 사용하여 배양한 후 plate 에 적절한 세포 수로 seeding 한다.
2. 100% confluent 한 상태에서 2-3일간 더 배양한다.
- Growth arrest 하기 위해서.
3. 분화 유도 물질인 MDI cocktail [insulin (5 μg/mL), dexamethasone (0.25 μM), 3-Isobutyl-1-methylxanthine (0.5 mM)] 을 포함한 DMEM-10% FBS 배지로 교환한 후 이틀 동안 배양한다.
- Mitotic clonal expansion (MCE) 단계
4. Insulin (5 μg/mL) 을 포함하는 DMEM-10% FBS 배지로 교환한 후 이틀 동안 배양한다.
5. DMEM-10% FBS 배지로 교환한 후 이틀 동안 더 배양한다
6. 이틀 후, 차가운 PBS로 두 번 세척한다.
7. 총 RNA를 TRI 시약으로 추출하고 정량 한 후 1 μg의 RNA를 2.5 mmol/L의 Mg2, 1 mmol/L dNTP, 0.5 μg oligodT15, 25 U의 AMV 역전사 효소와 10X RT buffer (750 mM KCL, 500 mM Tris-HCL, 30 mM MgCl2, pH 8.3) 를 포함하는 총 용적 20 μl의 멸균된 증류수에 용해시킨다.
8. 위 sample 을 25℃에서 10분, 42℃에서 60분, 99℃에서 5분간 반응시켜 cDNA로 역전사시킨다.
9. cDNA 를 DNase-free water 에 희석하고 primer 를 첨가해 real time PCR 한다. CPT-1의 primer는 다음과 같다.
   sense, 5’-ACCCTGAGGCATCTATTGACAG-3’
   antisense, 5’-ATGACATACTCCCACAGATGGC-3’
10. 50 ℃에서 2분, 95℃에서 10분, 95℃에서 15초, 55℃에서 60초 간의 주기로 40 cycle의 PCR 을 거친다.
11. mouse 18S rRNA 유전자를 내인성 reference 유전자로 하여 △△Ct 방법을 사용하여 정량한다.
결과해석
CPT-1의 발현이 증가되면 긴 사슬 지방산의 미토콘드리아 내막으로의 수송이 늘어나 지방산화가 촉진되므로 CPT-1의 mRNA 발현양이 증가 할수록 후보 물질이 항비만 효능이 있는 것으로 판단한다.
참고문헌 1. Hao J, Shen W, Yu G, Jia H, Li X, Feng Z, Wang Y, Weber P, Wertz K, Sharman E, Liu J, Hydroxytyrosol promotes mitochondrial biogenesis and mitochondrial function in 3T3-L1 adipocytes, J. Nutr. Briochem, 21(7) p634-644, 2010
2. Ejaz A, Wu D, Kwan P, Meydani M, Curcumin Inhibits Adipogenesis in 3T3-L1 Adipocytes and Angiogenesis and Obesity in C57/BL MICE1-3, J. Nutr., 139() p919-925, 2009
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제목 지방세포에서 CPT-1 유전자 발현 측정 링크 지방분해 증가
실험재료
필요장비 및 소모품
Real time qPCR System, UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water
 
필요시약
TRI reagent, AMV reverse transcriptase
 
실험방법 1. 세포 배양- 3T3-L1 fibroblast
1) 3T3-L1 fibroblast 를 10% bovine calf serum (BCS) 을 포함하는 DMEM 배지를 사용하여 배양한 후 plate 에 적절한 세포 수로 seeding 한다.
2) 100% confluent 한 상태에서 2-3일간 더 배양한다.
- Growth arrest 하기 위해서.
3) 분화 유도 물질인 MDI cocktail [insulin (5 μg/mL), dexamethasone (0.25 μM), 3-Isobutyl-1-methylxanthine (0.5 mM)] 을 포함한 DMEM-10% FBS 배지로 교환한 후 이틀 동안 배양한다.
- Mitotic clonal expansion (MCE) 단계
4) Insulin (5 μg/mL) 을 포함하는 DMEM-10% FBS 배지로 교환한 후 이틀 동안 배양한다.
5) DMEM-10% FBS 배지로 교환한 후 이틀 동안 더 배양한다.
 
2. 세포 배양- Rat 부고환 지방 세포 
1) 고지방식이(60% kcal fat) 로 비만을 유도한 수컷 SD rat 을 경추 탈골 시킨다.
2) 경추 탈골 시킨 동물의 겉을 포타딘이나 70% 알코올로 잘 소독시켜 clean bench안으로 옮긴다.
3) 화염 멸균된 가위로 동물을 개복한다.
4) 부고환에 연결된 지방을 분리하여 가위로 1~2 mm 정도로 잘게 자른다.
5) 멸균된 bottle 에 잘게 자른 지방과 Krebs-Ringer Hepes buffer (pH 7.4) 를 넣고 37% 에서 1 시간 동안 shaking 해준다.
6) buffer 위 층에 지방띠가 생긴다. 긴 파스퇴르 pipet 을 이용하여 지방띠 밑에 있는 buffer 를 제거해준다.
7) Bottle 안에 새로운 buffer를 넣어준 후 250 μm filter 를 씌운 주사기를 멸균 tube 에 받쳐 filter 해준다.
8) 500~600 rpm에서 5 분간 centrifuge한다.
9) 밑에 가라앉은 혈관 등은 버리고 위에 뜬 지방 세포 한 방울 (10 μL)을 hemotocytometer 에 떨어뜨린 후 그것을 뒤집어 cell 을 counting 한다.
10) 6 well plate에 5×104 cells/well로 seeding 한다.
 
3. RT-PCR을 이용한 CPT-1 발현 증가 시험법
1) 세포를 차가운 PBS로 두 번 세척해 준다. 3.5 cm 직경의 dish에 Trizol 시약 1 mL 을 첨가하여 세포를 lysis 시키고 스크래퍼로 세포를 긁어 모은다.
2) 파스퇴르 피펫을 이용해서 세포 lysate를 옮기고 10 분간 vortex 해준 뒤, 균질화된 시료를 5분간 실온에서 방치한다.
- nucleoprotein 복합체가 완전히 해리되기 위함이다.
3) 2,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 세포 잔유물을 제거하고 상등액을 1 mL 씩 1.5 mL eppendorf tube에 담는다. Eppendorf tube에 0.2 mL 의 chloroform을 담고 뚜껑을 꽉 닫은 후15초간 vortexing하고 실온에서 2~3분간 방치한다.
- 1 ml의 TRIZOL 시약에 0.2 ml의 chloroform 비율로 한다.
4) Sample들을 10,000 g, 4℃ 조건에서 15분간 원심 분리한다. 원심 분리 후, 세포들은 하층의 적색 phenol-chloroform 층, 중간층, 상층부의 무색의 층으로 나누어지는데 RNA는 상층부에 포함된다. 상층부를 중간층이 포함되지 않게 새 eppendorf tube 에 옮기고 처음에 첨가한 Trizol 1 mL 당 0.5mL 의 isopropyl alcohol 을 첨가해 RNA 를 침전시킨다.
Tips :
- 원심 분리 시, RNA를 효과적으로 분리하기 위해서 는 12,000 g를 넘지 않는다.
5) 실온에서 약 10분간 방치한 후에 10,000 g에서 4℃ 조건에서 10분간 원심 분리한다. 원심 분리 후에 RNA 침전들은 eppendorf tube 의 바닥이나 벽면에 pellet 으로 존재한다.
Tips :
- 원심분리 시 RNA를 효과적으로 분리하기 위해서 는 12,000 g를 넘지 않게 해야 된다.
6) 상청액을 완전히 제거한 후 처음에 넣은 Trizol 시약 1 mL 당 최소 1 mL 의 75% ethanol을 첨가하여 RNA pellet을 세척한다. Vortexing 한 후에 6,000 g, 4℃ 조건에서 5 분간 원심 분리한다. 이 과정을 한번 더 반복해준 뒤 에탄올을 모두 제거한다.
Tips :
- 원심분리 시 7,500 g를 넘으면 안됨.
7) 실온에서 5-10분 정도 RNA pellet을 방치하여 건조시킨 뒤 DEPC-treated water에 용해시킨다.
Tips :
- RNA를 완전히 건조하면 DEPC-treated water에 용해가 되지 않기 때문에 완전히 건조하지 않는 것이 중요하다.
8) RNA를 1/40 희석한 후 10 μL microcuvette을 이용해서 UV 분광광도계에서 260 nm와 280 nm에서 흡광도를 잰다.
Tips :
- 희석 할 때1 μL 의 RNA 용액을 39 uL 의 DEPC-treated water에 용해시킨다.
- OD260/OD280 ratio 는 1.6이상이 되어야 순도가 높은 것이고, 이하의 값이 나오는 RNA는 실험에 사용해서는 안 된다.
9) 260 nm에서의 OD값이 1일 때 40 μg/mL RNA 농도이고 OD값에 비례하여 RNA 농도를 산출한다.
10) 1 μg의 RNA를 2.5 mmol/L의 Mg2, 1 mmol/L dNTP, 0.5 μg oligodT15, 25 U의 AMV 역전사 효소와 10 X RT buffer(750 mM KCL, 500 mM Tris-HCL, 30 mM MgCl2, pH 8.3)을 포함하는 총 용적 20 μL 의 멸균된 증류수에 용해시킨다.
11) 위 sample을 25℃ 에서 10분, 42℃ 에서 60분, 99℃에서 5분간 배양하여 cDNA로 역전사 시킨다.
12) cDNA를 DNase-free water에 희석하고 primer를 첨가해 real time PCR 한다. CPT-1의 primer는 다음과 같다.
sense, 5’-ACCCTGAGGCATCTATTGACAG-3’
antisense, 5’-ATGACATACTCCCACAGATGGC-3’
13) 50 ℃에서 2분간 첫 배양한 후 cDNA를 95℃에서 10분간 변성시킨 후 95℃에서 15초간, 55℃에서 60초간의 주기로 40 cycle의 PCR 을 거친다.
14) mouse 18S rRNA 유전자를 내인성 reference 유전자로 하여 △△Ct방법을 사용하여 정량 한다.
실험결과 예
출처 : Hao J et al., 2010
결과해석
후보 물질을 처리함에 따라 CPT-1의 mRNA 발현이 1μM 처리군까지는 농도 의존성 있게 증가하여 유의성이 나타나지만 10 μM이상 처리에서는 오히려 CPT-1의 mRNA 발현이 감소하는 것으로 나타난다. 후보 물질의 CPT-1 활성은 1 μM에서 가장 효과가 좋다는 것을 알 수 있다.
참고문헌 1. Hao J, Shen W, Yu G, Jia H, Li X, Feng Z, Wang Y, Weber P, Wertz K, Sharman E, Liu J, Hydroxytyrosol promotes mitochondrial biogenesis and mitochondrial function in 3T3-L1 adipocytes, J. Nutr. Briochem, 21(7) p634-644, 2010
2. Ejaz A, Wu D, Kwan P, Meydani M, Curcumin Inhibits Adipogenesis in 3T3-L1 Adipocytes and Angiogenesis and Obesity in C57/BL MICE1-3, J. Nutr., 139() p919-925, 2009
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