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체지방감소

시험관내 및 세포실험법

제목 지방세포에서 AMPK 단백질 발현 측정
구분 체지방감소 링크 지방분해 증가
실험배경
비만은 에너지 섭취와 소비의 불균형에 의해 유발되며 지방세포의 비대(hypertrophy)와 지방전구세포에서 성숙한 지방세포로의 분화(hyperplasia) 등이 촉진된다. 유리지방산이 지방산화(fatty acid oxidation) 과정을 통해서 에너지로 이용되면서 과도하게 축적된 지방을 소비하는데 도움을 줄 수 있다. 많은 연구 결과들을 통하여 AMP-activated protein kinase (AMPK)가 세포 내 에너지 상태의 변화에 반응하여 대사 전환의 주된 조절자로써 탄수화물과 지방 대사에 중요한 역할을 담당하고 있음을 보여주고 있으며, AMPK 의 활성화가 비만과 대사성 질환을 개선시키기 위한 주요 marker 로서 큰 의미를 가짐을 나타내고 있다. 지방조직에서의 AMPK 활성화는 acetyl-CoA carboxylase (ACC) 를 불활성화시킴으로써 지방분해와 지방생성을 억제한다. 후보 물질의 항비만 효능 평가를 위한 방법으로는 후보 물질을 성숙한 지방세포에 처리하여 지방산화 과정에 관련된 유전자들의 발현 수준 변화를 확인하여 항비만 효능을 갖는지를 알아볼 수 있다.
실험재료
필요장비 및 소모품
Immun-Blot PVDF Membrane, 원심분리기 
 
필요시약
Ripa buffer(10X), Non-fat dry milk, Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X), ECL plus detection kit, Primary antibody AMPK, pAMPK  
 
세포주
3T3-L1 fibroblast(ATCC), 3T3-L1 adipocyte, Rat 부고환 지방세포  
실험방법
1. 3T3-L1 fibroblast 를 10% bovine calf serum (BCS) 을 포함하는 DMEM 배지를 사용하여 배양한 후 plate 에 적절한 세포 수로 seeding 한다.
2. 100% confluent 한 상태에서 2-3일간 더 배양한다.
- Growth arrest 하기 위해서.
3. 분화 유도 물질인 MDI cocktail [insulin (5 μg/mL), dexamethasone (0.25 μM), 3-Isobutyl-1-methylxanthine (0.5 mM)] 을 포함한 DMEM-10% FBS 배지로 교환한 후 이틀 동안 배양한다.
- Mitotic clonal expansion (MCE) 단계
4. Insulin (5 μg/mL) 을 포함하는 DMEM-10% FBS 배지로 교환한 후 이틀 동안 배양한다.
5. DMEM-10% FBS 배지로 교환한 후 이틀 동안 더 배양한다.
6. 차가운 PBS로 두 번 세척한 뒤, RIPA 완충용액(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% (v/v) Nonidet-p40, 0.5% (w/v) sodium deoxycholate, 0.1% (w/v) SDS, 1 mM Na3VO4, 10 μg/mL leupeptin, 50 mM NaF, 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF))으로 세포를 lysis 하고 scrapper 로 긁어 모은 후 얼음에서 1시간 동안 lysis 한다.
7. 원심분리기로 18,000 g로 4℃조건에서 20분간 원심 분리한 후, 상청액의 단백질 양을 정량한 후 30 μg의 단백질을 SDS-polyacrylamide gel로 전기 영동하여 분리하고 poly-vinylidene difluoride membrane 으로 transfer (이동) 시킨다.
8. Membrane 을 TBS-T (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.06% Tween-20) 에 용해된 5% (w/v) 건조 skim mik (건조 무지방 우유)로 30분간 blocking 한다.
9. p-AMPK 항체를 5 % BSA/TBS-T 용액에 1:1000 비율로 넣고 blocking 된 membrane 과 4℃ overnight 반응 시킨다.
10. TBS-T 용액으로 3~4번 washing 한다.
11. Membrane 을 2.5% (w/v) 탈지분유를 포함하는 TBS-T 에 녹인 horseradish peroxidase-conjugated 2차 항체와 30 분간 반응시킨다.
12. ECL plus detection kit로 immune complex (면역반응이 일어난 복합체)를 측정한다.
결과해석
후보 물질에 의해 AMPK의 활성화는 각각의 단백질을 인산화 시키며 지방세포의 β-산화를 이끌게 된다. 후보 물질에 의해 p-AMPK가 되면 β-산화가 증가되어서 항비만 효능을 갖는다고 판단한다.
참고문헌 1. Murase T, Misawa K, Haramizu S, Hase T, Catechin-induced activation of the LKB1/AMP-activated protein kinase pathway, Biochem. Pharmacol., 78(1) p78-84, 2009
2. Lorente-Cebrián S, Bustos M, Marti A, Martinez JA, Moreno-Aliaga MJ, Eicosapentaeonic acid stimulates AMP-activated protein kinase and increases visfatin secretion in cultured murine adipocytes, Clin. Sci., 117(6) p243-249, 2009
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제목 지방세포에서 AMPK 단백질 발현 측정 링크 지방분해 증가
실험재료
필요장비 및 소모품
Immu-Blot PVDF Membrane, Centrifuge
 
필요시약
Ripa buffer(10X), Non-fat dry milk, Tris Buffered Saline with Tween 20(TBST-10X), ECL plus detection kit, AMPK 1st antibody, p-AMPK 2nd antibody
 
실험방법
1. 세포 배양
- 3T3-L1 fibroblast
1) 3T3-L1 fibroblast 를 10% bovine calf serum (BCS) 을 포함하는 DMEM 배지를 사용하여 배양한 후 plate 에 적절한 세포 수로 seeding 한다.
2) 100% confluent 한 상태에서 2-3일간 더 배양한다.
- Growth arrest 하기 위해서.
3) 분화 유도 물질인 MDI cocktail [insulin (5 μg/mL), dexamethasone (0.25 μM), 3-Isobutyl-1-methylxanthine (0.5 mM)] 을 포함한 DMEM-10% FBS 배지로 교환한 후 이틀 동안 배양한다.
- Mitotic clonal expansion (MCE) 단계
4) Insulin (5 μg/mL) 을 포함하는 DMEM-10% FBS 배지로 교환한 후 이틀 동안 배양한다.
5) DMEM-10% FBS 배지로 교환한 후 이틀 동안 더 배양한다.
 
2. 세포 배양- Rat 부고환 지방 세포
1) 고지방식이(60% kcal fat) 로 비만을 유도한 수컷 SD rat 을 경추 탈골 시킨다.
2) 경추 탈골 시킨 동물의 겉을 포타딘이나 70% 알코올로 잘 소독시켜 clean bench안으로 옮긴다.
3) 화염 멸균된 가위로 동물을 개복한다.
4) 부고환에 연결된 지방을 분리하여 가위로 1~2 mm 정도로 잘게 자른다.
5) 멸균된 bottle 에 잘게 자른 지방과 Krebs-Ringer Hepes buffer (pH 7.4) 를 넣고 37% 에서 1 시간 동안 shaking 해준다.
6) buffer 위 층에 지방띠가 생긴다. 긴 파스퇴르 pipet 을 이용하여 지방띠 밑에 있는 buffer 를 제거해준다.
7) Bottle 안에 새로운 buffer를 넣어준 후 250 μm filter 를 씌운 주사기를 멸균 tube 에 받쳐 filter 해준다.
8) 500~600 rpm에서 5 분간 centrifuge한다.
9) 밑에 가라앉은 혈관 등은 버리고 위에 뜬 지방 세포 한 방울 (10 μL)을 hemotocytometer 에 떨어뜨린 후 그것을 뒤집어 cell 을 counting 한다.
10) 6 well plate에 5×104 cells/well로 seeding 한다.
 
3. Western blot 을 이용한 AMPK 발현 확인 시험법
1) 세포들을 차가운 PBS로 두 번 세척한 뒤, plate를 얼음 위에 올려놓은 뒤 RIPA 완충용액(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 % (v/v) Nonidet-p40, 0.5% (w/v) sodium deoxycholate, 0.1% (w/v) SDS, 1 mM Na3VO4, 10 ug/mL leupeptin, 50 mM NaF, 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)을 6 well plate 에 1 well 당 200 μL 씩 넣는다.
2) Scrapper 를 이용하여 세포가 떨어지도록 긁어준 후 Eppendorf tube에 담아 얼음물 상태에서 30분 동안 sonication해준다.
Tips :
- Sonication을 실시하는 동안 10분 마다 강한 vortex를 해주어야 많은 양의 protein이 추출된다.
3) 원심분리기로 18,000 g로 4℃조건에서 20분간 원심 분리한 후, 상청액을 ep-tube에 담아 단백정량을 한 후 모든 시료의 단백량을 동일하게 lysis buffer를 이용하여 맞춰준 후 실험 전까지 -80℃에 보관해둔다.
4) 실험하기 위해 -80℃에 보관해 두었던 시료를 얼음에 놓고 녹인다. 4X sample buffer (250 mM Tris-HCl (pH 6.8), 40% glycerol, 8% SDS, 4% β-mercaptoethanol, 0.2% bromophenol blue)를 sample에 함께 섞은 후 끓는 물에서 5분간 끓여 준다.
5) 30 μg의 단백질을 만들어 놓은 SDS-polyacrylamide gel (1.5 M Tris-HCl (pH 8.0), DDW, 30% acrylamide, 10% SDS, TEMED, 10% APS)에 loading한 후 10% SDS PAGE buffer (Tris base, glycine, SDS)를 이용하여 120 V에서 protein을 분리해준다.
Tips :
- stacking gel에서는 약 40분간 40 V에서 실시한다.
6) 전기영동이 끝나면 gel의 단백질을 Transfer buffer (Tris base, glycine, SDS, methyl alcohol)를 이용하여 PVDF membrane으로 옮겨준다.
Tips :
- Transfer buffer는 쉽게 뜨거워지므로 전기영동하는 동안 냉장고에 보관해 둔다. 냉동고에 보관되어 있는 얼음팩을 transfer buffer에 같이 넣어주면 buffer가 빨리 뜨거워지는 것을 방지할 수 있다. Buffer가 뜨거워지면 membrane이 타므로 주의해야 한다.
7) Transfer된 membrane을 납작한 통에 옮겨 TBS-T (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.06% Tween-20)에 용해된 5% (w/v) 건조 skim mik(건조 무지방 우유)에 용해된 5% skim milk를 부어 상온에서 1시간동안 Orbital shaker을 이용한 shaking상태에서 blocking을 실시한다.
Tips :
- blocking은 냉장에서 over night해도 무방하다.
8) Blocking이 끝나면 skim milk를 버리고 membrane에 남아있는 skim milk는 TBS-T로 한두 번 살짝 세척해준다.
Tips :
- 과도한 세척은 blocking 효과를 제거하게 되므로 납작한 통을 두 세 번씩 흔들기를 2번 실시해 준다.
9) AMPK, p-AMPK의 1차 항체를 5% BSA/TBS-T 에 희석한다.
Tip:
Antibody 희석배수는 information sheet에 나와 있으며 일반적으로는 1:1000을 해주는 것이 보통이다.
10) 희석한 1차 항체를 납작한 통에 membrane 이 잠길 정도로 부어준 후 냉장상태에서 overnight shaking해 준 후 TBS-T를 이용하여 5분씩 4버 정도 세척해준다.
11) AMPK, p-AMPK의 1차 항체와 동일한 host의 horseradish peroxidase-conjugated 2차 항체를 5% skim milk에 희석한 후, membrane이 잠길 정도로 부어준 후 상온에서 30 분 정도 반응시켜 준다.
Tips :
- 1:10,000 희석배수에서도 아주 잘 붙으며 붙지 않을 경우 희석배수를 조절한다.
12) TBS-T 를 이용하여 5분 간격으로 4번 세척해준다.
13) ECL plus detection kit로 immune complex (면역반응이 일어난 복합체)를 측정한다.
실험결과 예

출처 : Bustos M et al., 2009
결과해석
AMPK의 발현 수준은 시료처리에 따라서 차이가 없었으나 AMPK의 인산화된 형태인 p-AMPK의 발현이 농도 의존적으로 증가되는 것으로 보아 후보 물질이 β-산화 활성화 효능이 있는 것을 알 수 있다.
참고문헌 1. Murase T, Misawa K, Haramizu S, Hase T, Catechin-induced activation of the LKB1/AMP-activated protein kinase pathway, Biochem. Pharmacol., 78(1) p78-84, 2009
2. Lorente-Cebrián S, Bustos M, Marti A, Martinez JA, Moreno-Aliaga MJ, Eicosapentaeonic acid stimulates AMP-activated protein kinase and increases visfatin secretion in cultured murine adipocytes, Clin. Sci., 117(6) p243-249, 2009
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