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체지방감소

시험관내 및 세포실험법

제목 지방세포에서 UCP2 유전자 발현 측정
구분 체지방감소 링크 지방분해 증가
실험배경 Uncoupling protein (UCP2) 는 미토콘드리아 내막에 존재하는 미토콘드리아 수송체 (transporter)로서 ATP 합성으로부터 비동조화 호흡으로 열(heat) 을 만든다. UCP2는 여러 조직에서 광범위하게 발현되어 있고 특히, 지방세포에서 높은 수준으로 발현되어 있기 때문에 UCP2 발현의 조절이 유기체의 전체적인 에너지 균형을 조절하는데 중요하다. 수 많은 비만 관련 유전자 중에 UCPs이라 불리는 단백질은 설치동물에서는 매우 중요하게 작용하는 것으로써, 비만 관련 후보 유전자인 beta2, 3-ADR, PPAR gamma, lipoprotein lipase 및 UCP1, 2의 비만 관련성 연구에서 UCP2가 비만과 통계적으로 유의한 상관이 높은 유전자로써 비만한 사람은 UCP2 발현이 감소함을 보고하였다.
실험재료
필요장비 및 소모품
형광 온도 반복주기 기계, 원심분리기  
필요시약
SYBR GREEN I REAL-TIME PCR MASTER MIX, Trizol reagent , M-MuLV Reverse Transcriptase
 
세포주
mouse fibroblast 3T3-L1, 3T3-L1 adipocyte, Rat 부고환 지방세포 
실험방법
1. 세포 배양
- 3T3-L1 fibroblast
1) 3T3-L1 fibroblast 를 10% bovine calf serum (BCS) 을 포함하는 DMEM 배지를 사용하여 배양한 후 plate 에 적절한 세포 수로 seeding 한다.
2) 100% confluent 한 상태에서 2-3일간 더 배양한다.
- Growth arrest 하기 위해서.
3) 분화 유도 물질인 MDI cocktail [insulin (5 μg/mL), dexamethasone (0.25 μM), 3-Isobutyl-1-methylxanthine (0.5 mM)] 을 포함한 DMEM-10% FBS 배지로 교환한 후 이틀 동안 배양한다.
- Mitotic clonal expansion (MCE) 단계
4) Insulin (5 μg/mL) 을 포함하는 DMEM-10% FBS 배지로 교환한 후 이틀 동안 배양한다.
5) DMEM-10% FBS 배지로 교환한 후 이틀 동안 더 배양한다.
 
- 샘플 처리
1. 후보 물질은 분화 유도 전 또는 분화 유도 후 실험 목적에 따라 처리한다.
2. TRIzol 시약을 처리하여 총 RNA를 추출한 뒤, M-MLV 역전사 효소를 이용해서 5 μg의 RNA 로부터 cDNA를 합성한다.
3. cDNA 합성 후, fluorometric thermal cycler (형광 온도 반복주기 기계)를 이용해 25 uL의 Universal SYBR Green PCR Master Mix 안에서 95℃, 10분간 변성(denaturation) 과정을 거친 후 50 cycles PCR 을 거친다. 각 주기는 95℃에서 10초, 55℃에서 20초, 72℃에서 20초이다.
4. UCP2와 β-actin의 primer sense와 anti-sense 서열은 다음과 같다.
   UCP2:5’-CAGAGCAGGTTACAGTC-3’와 5’-TCAACCCCTTCATTACAGAC-3’
   β-actin:5’-GTTGCCAATAGTGATGACCT-3’와 5’-GGACCTGACAGACTACCTCA-3’
 
5. △△Ct 방법으로 상대적 정량을 한다.
결과해석 UCP2는 열을 생성하여 에너지 소비를 촉진하는 유전자로서 발현이 증가 할수록 항비만 효능이 있다고 판단 할 수 있다. 
참고문헌 1. Lee MS, KIM YH., (-)-Epigallocatechin-3-gallate Enhances uncoupling Protein 2 Gene Expression in 3T3-L1 Adipocytes., Biosci. Biotechnol. Biochem., 73(2) p434-436, 2009
2. Andrea A, Eduardo R, González-Barroso MM., Metformin induces oxidative stress in white adipocytes and raises uncoupling protein 2 levels., J Endocrinol., 199() p33-40, 2008
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제목 지방세포에서 UCP2 유전자 발현 측정 링크 지방분해 증가
실험재료
필요장비 및 소모품
Fluorometirc thermal cycler Rotor-Gene, Centrifuge
 
 
필요시약
SYBR GREEN Ⅰ REAL-TIME PCR MASTER MIX, Trizol reagent, M-MuLV Reverse Transcriptase
 
 
실험방법
1. 세포 배양
- 3T3-L1 fibroblast
1) 3T3-L1 fibroblast 10% bovine calf serum (BCS) 을 포함하는 DMEM 배지를 사용하여 배양한 후 plate 에 적절한 세포 수로 seeding 한다.
2) 100% confluent 한 상태에서 2-3일간 더 배양한다.
- Growth arrest 하기 위해서.
3) 분화 유도 물질인 MDI cocktail [insulin (5 μg/mL), dexamethasone (0.25 μM), 3-Isobutyl-1-methylxanthine (0.5 mM)] 을 포함한 DMEM-10% FBS 배지로 교환한 후 이틀 동안 배양한다.
- Mitotic clonal expansion (MCE) 단계
4) Insulin (5 μg/mL) 을 포함하는 DMEM-10% FBS 배지로 교환한 후 이틀 동안 배양한다.
5) DMEM-10% FBS 배지로 교환한 후 이틀 동안 더 배양한다.
 
2. 세포 배양- Rat 부고환 지방 세포
1) 고지방식이(60% kcal fat) 로 비만을 유도한 수컷 SD rat 을 경추 탈골 시킨다.
2) 경추 탈골 시킨 동물의 겉을 포타딘이나 70% 알코올로 잘 소독시켜 clean bench안으로 옮긴다.
3) 화염 멸균된 가위로 동물을 개복한다.
4) 부고환에 연결된 지방을 분리하여 가위로 1~2 mm 정도로 잘게 자른다.
5) 멸균된 bottle 에 잘게 자른 지방과 Krebs-Ringer Hepes buffer (pH 7.4) 를 넣고 37% 에서 1 시간 동안 shaking 해준다.
6) buffer 위 층에 지방띠가 생긴다. 긴 파스퇴르 pipet 을 이용하여 지방띠 밑에 있는 buffer 를 제거해준다.
7) Bottle 안에 새로운 buffer를 넣어준 후 250 μm filter 를 씌운 주사기를 멸균 tube 에 받쳐 filter 해준다.
8) 500~600 rpm에서 5 분간 centrifuge한다.
9) 밑에 가라앉은 혈관 등은 버리고 위에 뜬 지방 세포 한 방울 (10 μL) hemotocytometer 에 떨어뜨린 후 그것을 뒤집어 cell counting 한다.
10) 6 well plate 5×104 cells/well seeding 한다.
 
3. RT-PCR을 이용한 UCP발현 시험법
1) 세포를 차가운 PBS로 두 번 세척해 준다. 3.5 cm 직경의 dish Trizol 시약 1mL 을 첨가하여 세포를 lysis 시키고 scrapper 로 세포를 긁어 모은다.
2) 파스퇴르 피펫을 이용해서 세포 lysate를 옮기고 10 분간 Vortexing 해준 뒤, 균질화된 sample 5분간 실온에서 방치한다.
Tips :
- nucleoprotein 복합체가 완전히 해리되기 위함이다.
3) 2,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 세포 잔유물을 제거하고 상청액을 1 mL ep-tube에 담는다. Ep- Tube 0.2 mL chloroform을 담고 cap을 완전히 닫은 후15초간 vortexing하고 실온에서 2~3분간 방치한다.
Tips :
- 1 ml TRIZOL 시약에 0.2 mlchloroform 비율로 한다.
4) sample들을 10,000 g에서 4℃조건에서 15분간 원심 분리한다. 원심 분리 후, 세포들은 하층의 적색 phenol-chloroform , 중간층, 상층부의 무색의 수분을 포함한 층으로 나누어지는데 RNA는 상층부에 포함된다. 상층부를 중간층이 포함되지 않게 새로운 ep-tube에 옮기고 처음에 첨가한 Trizol 1 mL 0.5 mL isopropyl alcohol을 첨가해 RNA를 침전시킨다.
Tips :
- RNA를 효과적으로 분리하기 위해서 는 12,000 g를 넘지 않게 해야 된다.
5) 실온에서 약 10분간 방치한 후에 10,000 g에서 4℃조건에서 10분간 원심 분리한다. 원심분리 후에 RNA 침전들은 ep-tube의 바닥이나 벽면에 pellet을 띄고 있다.
Tips :
- 원심 분리 시 12,000 g를 넘지 않게 해야 된다.
6) 상청액을 완전히 제거한 후 처음에 넣은 Trizol 시약 1 mL 당 최소 1 mL 75 % ethanol을 첨가하여 RNA pellet을 세척한다. Vortexing하여 sample을 섞은 후에 6,000 g 4℃조건에서 5 분간 원심 분리한다. 이 과정을 한번 더 반복해준 뒤 에탄올을 모두 제거한다.
Tips :
- 원심 분리 시 7,500 g를 넘으면 안 된다.
7) 실온에서 5-10분 정도 RNA pellet을 방치하여 건조시킨 뒤 피펫을 이용해서 DEPC-treated water에 용해시킨다.
Tips :
- RNA를 완전히 건조하면 DEPC-treated water에 용해가 되지 않기 때문에 완전히 건조하지 않는 것이 중요하다.
8) RNA 1:40배 희석한 후10 μL microcuvette을 이용해서 UV 분광광도계에서 260 nm 280 nm에서 흡광도를 측정한다.
Tips :
- 1 μl RNA용액을 39 μL DEPC-treated water에 용해시킨다.
- OD260/OD280 ratio 1.6이상이 되어야 순도가 높은 것이고, 이 이하의 값이 나오는 RNA는 실험에 사용해서는 안된다.
9) 260nm에서의 OD값이 1일 때 40 μg/mL RNA 농도이고 OD값에 비례하여 RNA 농도를 산출한다.
10) M-MLV 역전사 효소를 이용해서 5 μg RNA 로부터 cDNA를 합성한다.
11) cDNA를 합성 후, fluorometric thermal cycler(형광 온도 반복주기 기계)를 이용해 25 μL Universal SYBR Green PCR Master Mix안에서 95℃에서 10분간 첫 변성(denaturation) 과정을 거친 후 50 PCR 주기를 거친다. 각 주기는 95℃에서 10, 55℃에서 20, 72℃에서 20초이다.
12) UCP2 β-actin primer sense antisense 서열은 다음과 같다.
UCP2:5’-CAGAGCAGGTTACAGTC-3’ 5’-TCAACCCCTTCATTACAGAC-3’
β-actin:5’-GTTGCCAATAGTGATGACCT-3’ 5’-GGACCTGACAGACTACCTCA-3’
13) △△Ct 방법으로 상대적 정량을 한다.
실험결과 예
결과해석
후보 물질 처리에 따라 UCP 2 mRNA의 발현이 증가되는 것으로 나타나 UCP 2에 의한 열생성이 후보 물질에 의해 촉진되어 항비만 효능이 있음을 알 수 있다.
참고문헌 1. Lee MS, KIM YH., (-)-Epigallocatechin-3-gallate Enhances uncoupling Protein 2 Gene Expression in 3T3-L1 Adipocytes., Biosci. Biotechnol. Biochem., 73(2) p434-436, 2009
2. Andrea A, Eduardo R, González-Barroso MM., Metformin induces oxidative stress in white adipocytes and raises uncoupling protein 2 levels., J Endocrinol., 199() p33-40, 2008
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