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체지방감소

시험관내 및 세포실험법

제목 지방세포에서 GPAT Ⅰ유전자 발현 측정
구분 체지방감소 링크 지방합성 억제
실험배경
비만은 과도한 에너지 섭취에 의해 지방이 합성되면서 일어나는데 GPAT-1은 adipogenesis과정에 관여하는 효소로 지방산과 glycerol을 저장형 triglyceride형으로 만드는 효소다. 따라서 GPAT-1의 발현이 감소되면 adipogenesis가 억제되어 항비만 효능이 있는 것으로 판단한다. 
실험재료
필요장비 및 소모품
형광 온도 반복주기 기계, 원심분리기  
필요시약
Power SYBERⓇ GREEN PCR MASTER MIX, Trizol reagent, MuLV Reverse Transcriptase
 
세포주
3T3-L1 fibroblast, 3T3-L1 adipocyte, Rat 부고환 지방세포 
실험방법
1. 3T3-L1 fibroblast를 10% bovine serum을 포함하는 DMEM 배지 (증식용 배지)를 사용하여 배양한 후 플레이트에 적절한 세포수로 배양한다.
2. 10% FBS를 포함한 DMEM (분화용 배지) 플레이트에 세포가 빈틈없이 자란 후 2-3일간 더 배양한다.
3. 세포를 분화 유도 물질인 insulin (5 μg/mL), dexamethasone (0.25 μM), 3-Isobutyl-1-methylxanthine (0.5 mM)을 포함한 배지로 교환한 후 2-3일간 배양한다.
4. 세포를 insulin (5 μg/mL)만 포함한 배지로 교환한 후 2-3일간 배양 후 10% FBS/DMEM 로 교환한 후 6-8일간 더 배양한다.
5. 배양한 지방세포에서 TRIzol 시약으로 총 RNA를 추출한 뒤 5 ml용적에 0.25 mg을 포함하게 한다.
6. 총 RNA를 65℃에서 10분 간 변성한 후 MuLV reverse transcriptase를 이용하여 20 ℃에서 15분 간, 42 ℃에서 30분 간, 95 ℃에서 5분간 배양하여 cDNA로 역전사한다.
7. cDNA를 1:50배 희석하여 forward와 reverse primer를 각 1 mM 가하여 Power SYBER Green PCR Master Mix을 이용해 95 ℃에서 10 분 배양한 후 95℃에서 15초, 60 ℃에서 1분간의 PCR 주기를 40번 반복하여 PCR 한다. 4) GPAT의 primer는 다음과 같다
sense: 5’-GGCATCTCGTATGATCGCAT-3’
antisense: 5’-GCAAAATCCACTCGGACGTA-3’
8. △△Ct법을 이용하여 정량 한다.
결과해석
GPAT-1은 adipogenesis과정에 관여하는 효소로 지방산과 glycerol을 저장형 triglyceride형으로 만드는 효소다. 따라서 GPAT-1의 발현이 감소되면 adipogenesis가 억제되어 항비만 효능이 있는 것으로 판단한다.
참고문헌 1. T Priego, J Sanchez, A Palou., Leptin intake during the suckling period improves the metabolic response of adipose tissue to a high-fat diet., Int. J. Obesity, 34(5) p809-819, 2010
2. Amiya K. Leslie K. Arun K., Induction of the Peroxisomal Glycerolipid-synthesizing Enzymes during Differentiation of 3T3-L1 Adipocytes., J Biol Chem., 275(13) p9441-9446, 2000
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제목 지방세포에서 GPAT Ⅰ유전자 발현 측정 링크 지방합성 억제
실험재료
필요장비 및 소모품
Fluorometirc thermal cycler Rotor-Gene, Centrifuge
 
필요시약
Power SYBR Green PCR Master Mix, Trizol reagent, M-MuLV Reverse Transcriptase
 
실험방법
1. 세포 배양- 3T3-L1 fibroblast
1) 3T3-L1 fibroblast를 10% bovine serum을 포함한 DMEM 배지로 키운다.
2) 75% 정도 세포가 자라면 trypsin 처리로 세포를 모은 후, 6 well plate에 2.5 x 105/mL 으로 well 당 2 mL 씩 분주한다.
3) 세포가 well에 꽉차게 자란 뒤 2-3일 간 더 배양한다.
Tips :
- 세포가 well에 가득 차지 않은 상태에서 분화를 유도하면 분화가 잘 안됨!
4) 10% FBS를 포함한 DMEM 배지에 0.5 mM IBMX, 1 μg/ml insulin, 1 μM dexamethasone을 넣은 분화 유도 배지를 만들어 48시간 동안 처리한다. 이 때 시험 물질을 같이 투여해 준다.
Tips :
- 계대수가 높은 세포를 사용할 경우, well 가장자리의 세포가 박리되어 떨어질 수 있음.
5) 1 μg/ml insulin 만을 포함한 10% FBS를 포함한 DMEM 배지로 교환한 후 48시간 배양한다.
6) 10% FBS를 포함한 DMEM 배지로 2일 간격으로 배지를 교환하면서 세포내에 지방이 축적되는 시점까지 6-9일간 더 배양한다.
 
2. 세포 배양- Rat 부고환 지방 세포
1) High calorie high fat diet(60% fat)로 비만을 유도한 수컷 SD rat을 경추탈골 시킨다.
2) 경추탈골 시킨 동물의 겉을 포타딘이나 70% 알코올로 잘 소독시켜 clean bench안으로 옮긴다.
3) 화염 멸균된 가위로 동물을 개복한다.
4) 부고환에 연결된 지방을 분리하여 가위로 1~2 mm 정도로 잘게 자른다.
5) 멸균된 bottle 에 잘게 자른 지방과 Krebs-Ringer Hepes buffer (pH 7.4)를 넣고 37% 에서 1 시간 동안 shaking 해준다.
6) buffer 위 층에 지방띠가 생긴다. 긴 파스퇴르 pipet을 이용하여 지방띠 밑에 있는 buffer 를 제거해준다.
7) Bottle 안에 새로운 buffer를 넣어준 후 250 uM filter 를 씌운 주사기를 멸균 tube 에 받쳐 filter 해준다.
8) 500~600 rpm에서 5분간 centrifuge한다.
9) 밑에 가라앉은 혈관 등은 버리고 위에 뜬 지방 세포 한방울 (10 ㎕)을 hemotocytometer 에 떨어뜨린 후 그것을 뒤집어 cell 을 counting 한다.
10) 6 well plat에 5×104 cells/well로 분주한다.
 
3. RT-PCR을 이용한 UCP발현 시험법
1) 세포를 얼음물 농도로 PBS로 두 번 세척해 준다. 3.5 cm 직경의 dish에 TRIZOL 시약 1ml을 첨가하여 세포를 lysis 시키고 스크래퍼로 세포를 긁어 모은다.
Tips :
- 세포 lysis 시킬 시10 cm2에 1 ml정도 첨가하고 세포 숫자에는 별 상관 없다, Trizol시약을 불충분하게 첨가하면 추출된 RNA에 DNA가 오염될 수 있으므로 주의한다.
2) 파스퇴르 피펫을 이용해서 세포 lysate를 옮기고 10 분간 Vortexing 해준 뒤
균질화된 sample을 5분간 실온에서 방치한다.
Tips :
- nucleoprotein 복합체가 완전히 해리되기 위함이다.
3) 2000 rpm에서 10분간 원심분리하여 세포 잔유물을 제거하고 상청액을 1 ml 씩 EP-tube에 담는다. Ep- Tube에 0.2 ml의 chloroform을 담고 cap을 완전히 닫은 후15초간 Vortexing하고 실온에서 2~3분간 방치한다.
Tips :
- 1 ml의 TRIZOL 시약에 0.2 ml의 chloroform 비율로 한다.
4) sample들을 10,000g에서 4℃조건에서 15분간 원심분리한다. 원심분리후 세포들은 하층의 적색 Phenol-chloroform 층, 중간층, 상층부의 무색의 수분을 포함한 층으로 나누어지는데 RNA는 상층부에 포함된다. 상층부를 중간층이 포함되지 않게 새로운 ep-tube에 옮기고 처음에 첨가한 Trizol 1 ml당 0.5 ml의 isopropyl alcohol을 첨가해 RNA를 침전시킨다.
Tips:
- RNA를 효과적으로 분리하기 위해서 는 12,000 g를 넘지 않게 해야 된다.
5) 실온에서 약 10분간 방치한 후에 10,000 g에서 4℃조건에서 10분간 원심분리한다. 원심분리 후에 RNA 침전들은 Ep-tube의 바닥이나 벽면에 pellet을 띄고 있다.
Tips :
- 원심 분리 시 12,000 g를 넘지 않게 해야 된다.
6) 상청액을 완전히 제거한 후 처음에 넣은 TRIZOL시약 1 ml 당 최소 1 ml의 75 % ethanol을 첨가하여 RNA pellet을 세척한다. Vortexing하여 sample을 섞은 후에 6,000 g로 4℃조건에서 5 분간 원심분리한다. 이 과정을 한번 더 반복해준 뒤 에탄올을 모두 제거한다.
Tips :
- 원심 분리 시 7,500 g를 넘으면 안된다.
7) 실온에서 5-10분 정도 RNA pellet을 방치하여 건조시킨 뒤 피펫을 이용해서 DEPC-treated water에 용해시킨다.
Tips :
- RNA를 완전히 건조하면 DEPC-treated water에 용해가 되지 않기 때문에 완전히 건조하지 않는 것이 중요하다.
8) RNA를 1:40배 희석한 후10 μl microcuvette을 이용해서 UV 분광광도계에서 260 nm와 280 nm에서 흡광도를 잰다.
Tips :
- 1 μl의 RNA용액을 39 μl의 DEPC-treated water에 용해시킨다.
- OD260/OD280 ratio는 1.6이상이 되어야 순도가 높은 것이고 이 이하의 값이 나오는 RNA는 실험에 사용해서는 안된다.
9) 260 nm에서의 OD값이 1일 때 40 μg/ml RNA 농도이고 OD값에 비례하여 RNA 농도를 산출한다.
10) 총 RNA를 5 ml용적에 0.25 mg을 포함하게 ep- tube에 넣고 65℃에서 10분 간 변성한 후 MuLV reverse transcriptase를 이용하여 20 ℃에서 15분 간, 42 ℃에서 30분 간, 95 ℃에서 5분간 배양하여 cDNA로 역전사한다.
11) cDNA를 1:50배 희석하여 forward와 reverse primer를 각 1 mM 가하여
Power SYBER Green PCR Master Mix을 이용해 95 ℃에서 10 분 배양한 후 95℃에서 15초, 60 ℃에서 1분간의 PCR 주기를 40번 반복하여 PCR 한다.
12) GPAT의 primer는 다음과 같다
sense: 5’-GGCATCTCGTATGATCGCAT-3’
antisense: 5’-GCAAAATCCACTCGGACGTA-3’
13)△△Ct법을 이용하여 정량 한다. 
실험결과 예
출처 : Amiya K et al., 2000
결과해석
후보물질 처리에 따라 GPAT의 발현이 감소하였으므로 후보 물질이 lipogenesis 억제에 의한 항비만 효능이 있음을 알 수 있다.
참고문헌 1. T Priego, J Sanchez, A Palou., Leptin intake during the suckling period improves the metabolic response of adipose tissue to a high-fat diet., Int. J. Obesity, 34(5) p809-819, 2010
2. Amiya K. Leslie K. Arun K., Induction of the Peroxisomal Glycerolipid-synthesizing Enzymes during Differentiation of 3T3-L1 Adipocytes., J Biol Chem., 275(13) p9441-9446, 2000
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