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피부건강

시험관내 및 세포실험법

제목 Tyrosinase 효소 활성 저해능 측정
구분 피부건강 링크 자외선에 의한 피부보호
실험배경 피부노화는 시간의 경과에 따라 자연적으로 일어나는 내재적 노화와 햇빛이나 대기오염 같은 외부 요인에 의해 발생하는 외재적 노화로 나뉜다. 인간의 피부는 크게 표피층 (Epidermis)와 진피층 (Dermis)로 구성되어 있는데 시간에 경과에 따라 피부 노화가 진행되면 그 결과로 멜라닌 색소의 양이 많아 진다.
실험재료
필요장비 및 소모품
Spectrophotometer, 96 well plate, water bath, multipipette 
필요시약
Buffer : pH 6.8, 0.1 M potasium phosphate buffer,
Substrate : Tyrosine 0.03 % (0.3 mg/ml in D.W),
Enzyme solution : units/㎕(in 0.1 M phosphate buffer) 
세포주
 
실험방법
1. 반응액을 만든다.
 
대조군(control)
반응액
Buffer
500
500
Substrate
500
500
Enzyme solution
50
50
D.W
450
450
Inhibitor
-
50
2. 위의 반응액을 37도씨에서 10분간 반응시킨 후 신속하게 ice에서 5분간 방치하여 반응을 중단시킨다.
3. 475 nm에서 흡광도를 측정한다.
4. 다음과 같은 식으로 tyrosinase inhibition rate를 산출한다.
    % inhibition = [(A-B)/A] ⅹ100
    A : 시험시료(inhibitor)가 들어있지 않은 반응액(control)의 반응 후 흡광도
    B : 시험시료가 들어있는 반응액(reaction)의 반응 후 흡광도.
5. 시험시료(inhibitor)의 활성을 정량화하기 위하여 IC50을 구한다.
결과해석 시험시료를 적당한 농도로 용매에 녹인 후 연속 희석하여tyrosinase inhibition rate를 구한 뒤 이 결과를 도표화하여 tyrosinase의 활성을 50 % 저해하는 시료의 농도를 산출한다. 
IC50이 낮을수록 저해활성이 높다고 판단할 수 있으며 멜라닌 합성을 저해하므로 미백효능이 있다고 할 수 있다.
참고문헌 1. 고주영, 김영철, 삼릉 에탄올추출물의 in vitro 피부 미백 유효성, 환경독성보건학회지, 25(1) p69-77, 2010
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제목 Tyrosinase 효소 활성 저해능 측정 링크 자외선에 의한 피부보호
실험재료
필요장비 및 소모품
Inverted microscope (범용), 세포 배양기 (범용), 원심분리기 (범용), Cell culture dish (Falcon), Sepctrophotometer
 
필요시약
RPMI-1640(Thermo), Fetal bovine serum(FBS) (Gibco), Penicillin/streptomycin (Gibco), 0.5% Trypsin-EDTA (gibco), Phosphate buffer saline (PBS) (바이오세상), TPA 200 nM, protein assay 용액(Bio Rad, USA)
 
실험방법
1. Melan-a 세포를 10% FBS1% P/S, 200 nM TPA가 함유된 RPMI-1640 배지에 푼다.
2. 37, 5% CO2, incubator에서 72시간 동안 안정화 시킨다.
3. 안정화 된 세포를 실험에 사용한다.
4. Melan-a 세포를 둥근 60φ cell culture dish에 적정 세포수(4×10^5 cells/well)로 분주한다.
5. 37, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한다.
6. 시료를 농도별(ppm)로 희석시킨다.
7. 희석된 시료를 5 mL씩 넣고 37, 5% CO2 incubator에서 72시간 배양한다.
8. 배지를 제거한다.
9. PBS로 세척한다.
10. 얼음 위에 얹는다.
11. 1% triton X-100200μL 넣어 용해시킨다.
12. e-tube에 옮겨 얼음에 고정시킨다.
13. 10분 간격으로 vortex 하면서 1시간 동안 방치한다.
14. 414000 rpm에서 20분간 원심분리한다.
15. 원심분리 후 생긴 상층액을 tyrosinase 활성 측정 용액으로 사용한다.
16. protein assay 용액(Bio Rad, USA)으로 흡광도를 측정한다.
17. 동량의 단백질 양을 계산한다.
18. 단백질 40μg을 포함한 cell extract와 시험물질을 총 100μL가 되게 섞는다.
19. L-DOPA100μL씩 넣는다.
20. 37, 5% CO2 incubator에 넣어 490 nm에서 10분 간격으로 1시간 동안 흡광도의 변화를 측정한다.
실험결과 예
1.jpg
출처 : 고주영 et al., 2010 
결과해석
Melan-a 세포와 Melan-a 세포추출물에 시료(SREE)를 처치하고 시간별로 측정한 tyrosinase 활성 저해능은 농도의존성 정적(+) 반응을 보였다.
반응 60분에 양성대조군인 PC 150 ppm은 각각 31.2%, 27.7% 저해한 반면, 시료(SREE) 150 ppm 처리군은 각각 55.2%, 46.0% 저해하여 시료(SREE)의 우수한 tyrosinase 활성 저해능을 확인하였다.
참고문헌 1. 고주영, 김영철, 삼릉 에탄올추출물의 in vitro 피부 미백 유효성, 환경독성보건학회지, 25(1) p69-77, 2010
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