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피부건강

시험관내 및 세포실험법

제목 인간 진피 섬유아세포를 이용한 MMP-2 단백질 발현 측정
구분 피부건강 링크 자외선에 의한 피부보호
실험배경
피부는 크게 표피층(epidermis), 진피층(dermis), 피하조직층(subcutaneous layer)으로 구분할 수 있다. 이 중 피부의 표피층은 끊임없이 재생되고 또한 노화된 세포는 외부로 떨어져 나가는데 비하여 진피층은 섬유성분과 기질성분으로 구성되어 있으며 진피에 분포하는 모세혈관과 신경이 표피에 영양분을 보충해 주므로 피부의 노화와 밀접한 관련이 있다.
피부주름은 대표적인 피부노화의 바이오마커이다. 피부주름은 UVB와 같은 외부요인에 의해 피부 구조를 유지하는 섬유아세포가 파괴되거나 피부 진피층의 70% 이상을 차지하며 피부 항상성을 유지하는 콜라겐과 탄력섬유의 합성이 감소되고 세포 외 기질단백질의 분해 효소인 MMPs의 발현이 증가한다. 따라서 피부 진피층의 섬유아세포의 과다한 기질분해 효소를 억제하고 콜라겐 전구체의 발현을 조절하는 것은 여러 자극에 대한 피부건강을 유지하는데 중요한 지표가 될 수 있다.
항노화에 대한 효능 평가를 위한 방법으로는 후보물질을 인간 진피 섬유아세포주인 HDF에 처리하여 유도된 MMP(matrix metalloproteinase-2)의 발현효과를 western blotting 기법을 통해 측정하는 것이 있다. 이 중 MMP-2UV로 유도된 광노화에 있어 그 발현량이 변하지 않아 MMP-1이 발현되는 경향을 살펴보고자 할 때 항존유전자(Housekeeping gene)과 같은 역할을 하며 MMP-2Zymography 기법을 이용하여 확인할 수 있다.
대상 세포주는 진피 윗부분에 주로 분포하며 콜라겐, 탄력섬유, 글리코스아미노글리칸과 같은 구조물질을 합성한다. 다른 피부 세포주들에 비해 제한된 계대수(Passage number)를 가지기 때문에 주기적으로 세포를 교환해야 하는 단점이 있긴 하지만, 인간 진피층에서 분리해낸 세포이기 때문에 in vitro에서 주름과 관련된 실험을 하기에 가장 적합한 세포 주이다.
실험재료
필요장비 및 소모품
자외선 조사기, 세포배양 dish, 세포배양기, SDS-PAGE 전기영동장치 
필요시약
세포배양 배지(DMEM), 우태아혈청, 단백질 assay kit, Renaturing buffer, Developing buffer, Staining buffer, Destaining buffer 
세포주
인간피부진피세포(Human dermal fibroblast) 
실험방법 1. DMEM 세포배양 배지를 이용하여 적절한 조건으로 세포를 배양한 후 적정한 수로 세포를 배양 dish에 넣어 배양한다.
2. 세포가 dish 에 가득 차면 serum-free 배지로 24시간 starvation 한다.
3. 효능을 평가하고자 하는 소재를 적절한 농도로 배지에 넣어주어 1시간 전처리 후 자외선 조사기를 이용하여 UVB 0.02 J/㎠를 쪼여준다.
4. 배지를 수거하여 배지에 존재하는 단백질 양을 단백질 assay kit를 활용하여 측정한다.
5. Zymograph를 하기 위하여 동량의 단백질과 sample buffer를 넣어주고 Heatblock 과정없이 준비하여 전기영동 후에도 단백질의 활성을 잃지 않도록한다.
6. 단백질을 gel에 분리시킨 후 gel을 분리하여 renaturing buffer로 10분간 반응시켜 SDS를 씻겨낸다(3회).
7. 다음 Developing buffer로 2회 10분간 반응시킨 후 37℃ shaking Water bath에 Overnight한다.
8. Developing buffer를 제거한 후 staining buffer로 gel을 염색하고 염색이 진하면 Destaining buffer로 탈색하여 band를 확인한다.
결과해석
zymography 실험기법은 단백질의 활성정도를 측정하는 기법으로 gel band형태로 MMP-2의 활성이 나타나게 된다. Staining clear band가 모두 동일한 크기로 나오면 동량의 단백질을 넣었다고 판단할 수 있다.
참고문헌 1. TAKASHI KOBAYASHI, SHUNJI HATTORI, HIROSHI SHINKAI, Matrix Metalloproteinases-2 and -9 are Secreted from Human, Acta Derm Venereol, 83() p105-107, 2003
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제목 인간 진피 섬유아세포를 이용한 MMP-2 단백질 발현 측정 링크 자외선에 의한 피부보호
실험재료
필요장비 및 소모품
UVB cross-linker (Vilber lourmat), Inverted microscope (범용), 세포 배양기 (범용), 원심분리기 (범용), SDS-PAGE-전기영동장치 (범용), Cell culture dish (Falcon), Water bath (범용) 
필요시약
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM) (Thermo), Fetal bovine serum(FBS) (Gibco), Penicillin/streptomycin (Gibco), 0.5% Trypsin-EDTA (gibco), Phosphate buffer saline (PBS) (바이오세상), DC Protein Assay (Bio rad), PROTEIN-PAGE-10% (바이오세상), , PROTEIN-PAGE-5% stacking gel (바이오세상), 5X SDS loading buffer (바이오세상), 10X Tris-Glycine Buffer (바이오세상), 4X Transfer Buffer (바이오세상), Zymogram Renaturing Buffer (10X) (Novex?), Zymogram Developing Buffer (10X) (Novex?), Coomassie brilliant blue 
실험방법
1. 배지 조성
배양용 배지 : DMEM배지 450 ml에 FBS 50 ml, Antibiotic(Strep./Peni.) 1 ml을 각 농도에 맞게 첨가해준 후 잘 흔들어준 후 24시간 정치 후 사용한다.
Serum-free 배지 : DMEM배지에 Antibiotic(Strep./Peni.) 1 ml을 각 농도에 맞게 첨가해준 후 잘 흔들고 24시간 정치 후 사용한다.
 
2. 세포 배양, 시료 처리, 단백질 prep
1) 무균작업대에서 6 cm 배양 접시에 cell을 3 x 104개 seeding한 후 24시간 후에 serum starvation을 16~24시간 한다.
2) Serum starvation된 세포에 처리할 시료를 starvation 배지에 적정 농도로 섞은 후 배양기에서 6시간 동안 배양한다.
3) Media를 딴 후, 14000rpm, 4℃, 10min로 centrifuge하여 상층액을 다른 Tube에 옮긴다.
 
3. Loading
1) 준비된 sample의 단백질 양을 DC protein assay kit을 이용하여 정량하여 20μg 농도가 되도록 SDS sample buffer(DTT 없어야 함)에 동량을 섞어준 후 30분간 반응시킨다.
2) gel 내의 SDS를 빼주기 위해 55~60V, 15~20min간 pre-running을 한다.
3) pre-running이 끝난 후 gel에 Loading 하고 90V 20분, 110V로 90분 전기영동한다.
Tips:
- 12 % SDS-polyacrylamide gelatin gel 만드는 법
0.1% gelatin이 들어있는 PROTEIN-PAGE-12% 용액 : APS : TEMED = 8 ml : 40 ul : 8 ul의 비율로 50 ml tube에 담아 잘 섞은 후 casting에 넣는다. Gel 넣고 70% 에탄올을 채워준다. Gel이 굳으면 70% 에탄올을 버리고 comb을 꽂는다. 5% Stacking gel (PROTEIN-PAGE-5% stacking gel 용액 APS : TEMED = 4 ml :50 ul : 4 ul)을 1000 ul pipette을 사용하여 comb 사이로 넣어주어 gel을 굳힌다.
 
4.전기영동이 끝나면 gel을 renaturing bfr로 30분간 rocker에서 반응시킨다. (3회 반복)
5.developing bfr로 10분 2번 rocker에서 반응시키고 3번째 넣은 후 water bath에서 overnight한다 (rpm: 50)
6.coomassie briliant blue용액으로 1시간 염색시킨다.
7.상황에 따라 overdye된 경우 Destaining bfr로 탈색한다.
8. 사진으로 파인 band를 찍는다.
실험결과 예
1.jpg
MMP-2의 activity가 동일하게 발현됨을 zymography를 통해 확인할 수 있다.
결과해석 UV로 유도된 광노화에 있어 그 발현량이 변하지 않아 MMP-1이 발현되는 경향을 살펴보고자 할 때 항존유전자(Housekeeping gene)과 같은 역할을 하는 MMP-2는 각각 다른 샘플처리 군이어도 같은 크기의 band를 확인할 수 있어야 한다.
참고문헌
첨부파일
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