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피부건강

시험관내 및 세포실험법

제목 인간 진피 섬유아세포를 이용한 AQP3 단백질 발현 측정
구분 피부건강 링크 피부보습
실험배경
피부노화는 시간의 경과에 따라 자연적으로 일어나는 내재적 노화와 햇빛이나 대기오염 같은 외부 요인에 의해 발생하는 외재적 노화로 나뉜다. 인간의 피부는 크게 표피층 (Epidermis)와 진피층 (Dermis)로 구성되어 있는데 시간에 경과에 따라 피부 노화가 진행되면 그 결과로 콜라겐이 감소하고 피부 탄력이 떨어지며 수분 손실이 증가한다. 따라서 세포막에 존재하는 aquaglyceroporin인 Aquaporine3(AQP3)의 증가를 확인하는 것이 피부 수분을 보존하고 노화를 예방하는 좋은 전략이 될 수 있다.

피부의 보습 효능 평가 연구를 위해서 human foreskin으로부터 Primary culture를 통해 얻어지는 세포인 Human dermal fibroblast cell을 주로 이용하는데 이는 사람의 foreskin으로부터 얻어지는 섬유아세포로 dermis에서의 보습효능을 보는 In vitro 실험 중 가장 인체와 가까운 방법이라고 할 수 있다. 따라서 HDF 세포에 후보 물질을 처리하여 AQP3의 발현을 Western blotting 기법으로 측정하면 된다. 항노화의 효능평가에 대한 AQP3의 발현정도 측정은 가장 직접적인 효능평가 플랫폼 기술이라 할 수 있다.
실험재료
필요장비 및 소모품
세포배양기, 원심분리기, Inverted microscope, SDS-PAGE 전기영동장치, Western blot확인장치 (X-ray film, OHP firm ), 세포배양 dish 
필요시약
세포배양 배지(DMEM), 우태아혈청, Protein Quatitation assay kit, AQP3 1차 항체, PVDF membrane, TBS-T용액, Skim milk, 5% BSA in TBS-T, 2차 항체, Chemiluminescent reagent  
세포주
인간피부진피세포 (HDF) 
실험방법
1. DMEM 세포배양 배지를 이용하여 적절한 조건으로 세포를 배양한 후 적정한 수로 세포를 배양 dish에 넣어 배양한다.
2. 세포가 dish 에 가득 차면 serum-free 배지로 24시간 starvation 한다.
3. 효능을 평가하고자 하는 소재를 포함한 배지로 바꾼 후 6시간 동안 배양한다.
4. 6시간 후 Cell을 lysis 한 후 Protein assay kit를 활용하여 단백질 양을 측정한다.
5. 동량의 단백질을 Western blotting을 하기 위하여 sample buffer를 넣어주고 95℃에서 5분간 가열하여 전기영동시 단백질의 크기대로 분리되도록 처리한다.
6. SDS-PAGE 전기영동장치를 이용하여(AQP3의 경우 10% SDS-polyacrylamide gel이용) 단백질 크기대로 분리한다.
7. 분리 후 PVDF membrane에 단백질을 Transfer해 주고 5% Skim milk를 이용하여 membrane을 blocking 한다 (1시간)
8. AQP3 protein에 특이적으로 결합하는 1차 항체를 5% BSA in TBS-T에 적정농도로 희석하여 membrane에 넣고 4℃에서 overnight으로 반응시킨다.
9. TBS-T solution을 활용하여 10분씩 3번 1차 항체를 씻어주고 2차 항체를 1시간 반응시킨다.
10. 2차 항체를 TBS-T solution을 이용하여 8분씩 5번 Washing한 뒤 암실에서 X-ray film을 활용하여 AQP3의 발현정도를 측정한다.
결과해석
Western blotting 실험기법은 단백질의 발현정도를 측정하는 기법으로 film 에 band 형태로 AQP3의 발현이 나타나게 된다. 따라서 band가 진하게 나오면 AQP3의 발현이 높다고 평가하고 band의 진하기가 옅게 나오면 AQP3의 발현이 낮다고 평가할 수 있다.
AQP3 유전자가 사멸되면 각질층의 수분 함량의 저하가 나타나 피부 보습에 중요한 역할을 하므로, AQP3의 발현량이 높을 수록 피부 보습력이 높아진다고 판단할 수 있다.
참고문헌 1. Cong CAO, Yun SUN, Sarah HEALEY, Zhigang BI, Gang HU§, Shu WAN, Nicola KOUTTAB, Wenming CHU and Yinsheng WAN, EGFR-mediated expression of aquaporin-3 is involved in human skin fibroblast migration, Biochemical Journal, 400() p225-234, 2006
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제목 인간 진피 섬유아세포를 이용한 AQP3 단백질 발현 측정 링크 피부보습
실험재료
필요장비 및 소모품
도립현미경 (Inverted microscope), 세포 배양기, 원심분리기, SDS-PAGE-전기영동장치, Transfer장치, Cell culture dish, X-ray film, Cassette, PVDF membrane, Agfa medical X-ray film, OHP film 
필요시약
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Fetal bovine serum (FBS), Penicillin/streptomycin, Trypsin-EDTA, Phosphate buffer saline (PBS), DC Protein assay, PROTEIN-transfer buffer, cell lysis buffer (10X), ECL plus reagent, Skim milk, Tris buffer with Tween 20 (TBST), AQP3 goat polyclonal antibody, Monoclonal anti0actin, goat anti-rabbit IgG-HRP, Goat Anti-Mouse IgG (H+L), HRP Conjugate, VIVID developer, VIVID fixer, methyl alcohol 
실험방법
1. 배지조성
배양용 배지 : DMEM 배지 450 mL에 FBS 50 mL, Antibiotic (Strep./Peni.) 1mL을 각 농도에 맞게 첨가하여 잘 흔들어준 후 24시간 정치 후 사용한다.
Serum-free 배지 : DMEM 배지에 Antibiotic (Strep./Peni.) 1mL을 각 농도에 맞게 첨가하여 잘 흔들어준 후24시간 정치 후 사용한다.
 
2. 세포 배양, 시료 처리, 단백질 prep
1) 무균작업대에서 6 cm 배양 접시에 cell을 1 x 10^5개 seeding한 후 48시간 후에 serum starvation을 24시간 한다.
2) Serum starvation된 세포에 처리할 시료를 starvation 배지에 적정 농도로 섞은 후 배양기에서 3시간 동안 배양한다.
3) 배지를 suction 한 후 Cold PBS 2 ml로 2번 washing 해 준다.
4) 남아 있는 PBS를 완전히 제거한 후 cell lysis buffer 80 ul 를 넣고 얼음판 위에 올려놓는다.
5) 얼음 위에서 scraper를 이용하여 6 cm 배양 접시의 세포를 긁어 모아 tube에 담아 얼음에서 10 분에 한번씩 총 3번 vortexing 해준다.
6) 14000 rpm, 10 min 으로 centrifuge 해 배지 안의 죽은 세포를 침전시킨 후 상층액을 다른 tube로 옮긴다.
 
3. Loading, Blotting
1) 농축된 배지의 단백질 양을 DC protein assay kit을 이용하여 정량하여 SDS sample buffer에 동량을 섞어준다.
2) 5분간 95℃에서 Heat boiling해준 후 얼음에서 냉각해준다.
3) 10% SDS-polyacrylamide gel에 Loading 하고 90V 20분, 110V로 90분 전기영동한다.
Tips:
- 10 % SDS-polyacrylamide gel 만드는 법
PROTEIN-PAGE-10% 용액 : APS : TEMED = 8 mL : 40 uL : 8 uL의 비율로 50 mL tube에 담아 잘 섞은 후casting에 넣는다. Gel 넣고 70% 에탄올을 채워준다. Gel이 굳으면 70% 에탄올을 버리고 comb을 꽂는다. 5% stacking gel (PROTEIN-PAGE-5% stacking gel 용액 APS : TEMED = 4 mL : 50 uL : 4 uL)을 1000 uL pipette을 사용하여 comb 사이로 넣어주어 gel을 굳힌다.
 
4. 전기영동이 끝나면 젤을 메탄올에 activation 시킨 PVDF membrane으로 transfer한다.
TIps:
- Transfer 방법
스폰지-3M paper-PVDF membrane-gel-3M paper-스폰지>의 형태로 샌드위치 모양을 만든 후, Transfer buffer를 충분히 적신 후 90~110 mA로 100~120분 transfer 한다.
5. PVDF Membrane을 메탄올에 담궈 activation 시킨 후 5% skim milk (Skim milk 25 g + 500 ml TBST)에 2시간 blocking 을 해준다.
6. AQP3 antibody를 5% skim milk-TBST solution에 1:1000 배수로 희석한 용액에 PVDF membrane를 담가4℃에서 overnight으로 gently shaking한다.
7. TBST solution으로 10분씩 세 번 washing을 해준다.
8. 2차 anti goat antibody를 5% skim milk에 1:5000 배수로 희석한 후, 상온에서 1시간 동안 붙여준다.
9. 2차 antibody를 붙인 후 TBST solution으로 10분씩 세 번 washing 해준다.
10. Film 현상
Tips:
- Developer, Fixer, 카세트, membrane 당 2개의 OHP film, ECL plus, pipetter, 물통을 준비한다.
1) 암실에서 문을 잠그고 불 켠 채로 카세트를 꺼낸다.
2) 카세트 안을 깨끗이 닦은 후 OHP film을 깐다.
3) 불을 끄고 developer와 fixer를 각각의 통에 넣는다.
4) E-tube에 ECL + A 500 ul와 B 12.5 ul를 섞는다.
5) 폐액통에 TBST 용액을 완전히 털어 버린 후 e-tube에 섞어 놓은 reagent를 membrane에 골고루 뿌려준다.
6) 핀셋으로 끝에 잡아 OHP film위에 올리고 다른 OHP film으로 덮고 핸드타올로 기포를 제거한다.
7) 그 위에 AGFA film을 올리고 카세트를 닫는다.
8) 카세트를 열어 AGFA film을 꺼내 developer 통에 담궈 현상하고 fixer에 담근다.
9) 불을 켜기 전에 developer, AGFA film, ECL + 용액을 정리 한다.
10) 나온 film들을 가지고 간 물통에 옮겨 담아서 나온다.
실험결과 예
 
 
출처 : Cong CAO et al., 2006
결과해석
Western blotting 실험기법은 단백질의 발현정도를 측정하는 기법으로 film 에 band 형태로 AQP3의 발현이 나타나게 된다. 따라서 band가 진하게 나오면 AQP3의 발현이 높다고 평가하고 band의 진하기가 옅게 나오면 AQP3의 발현이 낮다고 평가할 수 있다.
AQP3 발현이 적어지게되면 각질층의 수분 함량의 저하가 나타나 피부 보습에 중요한 역할을 하므로, AQP3의 발현량이 높을 수록 피부 보습력이 높아진다고 판단할 수 있다.
참고문헌 1. Cong CAO, Yun SUN, Sarah HEALEY, Zhigang BI, Gang HU§, Shu WAN, Nicola KOUTTAB, Wenming CHU and Yinsheng WAN, EGFR-mediated expression of aquaporin-3 is involved in human skin fibroblast migration, Biochemical Journal, 400() p225-234, 2006
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