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피부건강

시험관내 및 세포실험법

제목 Melan-a세포에서 멜라닌 생성 측정법
구분 피부건강 링크 자외선에 의한 피부보호
실험배경

피부노화는 시간의 경과에 따라 자연적으로 일어나는 내재적 노화와 햇빛이나 대기오염 같은 외부 요인에 의해 발생하는 외재적 노화로 나뉜다. 인간의 피부는 크게 표피층 (Epidermis)와 진피층 (Dermis)로 구성되어 있는데 시간에 경과에 따라 피부 노화가 진행되면 그 결과로 멜라닌 색소의 양이 많아 진다.

melan-a세포는 non-tumorigenic mouse melanocyte cell line으로써 C57BL 의 embryo로부터 유래한 세포이다. 정상 mouse melanocyte의 성질을 대부분 가지고 있으면서도 immortalization되어 있어 실험에 이용하기 적당하다.

멜라닌 세포를 이용하는 이 측정법은, tyrosinase를 쓰는 방법에 비해 색소 세포 전체의 여러 가지 멜라닌 생성계에의 영향을 해석할 수 있다는 장점이 있으며, 멜라닌 생성에 대한 효과를 세포 pellet의 색으로 판단할 수도 있고 흡광도로 측정할 수도 있으며, HPLC를 이용하여 pheomelanin, eumelanin 분별 정량도 가능하다는 장점이 있다.

실험재료
필요장비 및 소모품
세포배양기, Water bath, 세포배양 Dish, 원심분리기, 현미경 
필요시약
RPMI-1640, Fetal bovine serum
 
세포주
melan-a 세포 
실험방법
1. melan-a 세포의 배지조건은 다음과 같다.
   RPMI-1640, pH 7.0-7.1
   Penicillin, 100,000 U/L
   Streptomycin sulphate, 100mg/L
   Glutamine 2mM
   Fetal bovine serum 10%
   TPA(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate), 200nM
2. 37℃ 5% CO2 조건 하에서 세포를 배양한다.
3. 24 well plate에 105 cell/well로 접종하고, 세포부착을 위해 24시간 배양한다.
4. 세포의 부착을 확인하고 시험물질을 처리한다. 3일 동안 매일 처리하고, 시험물질은 적당한 용매에 최종처리농도의 100배로 만든다.
5. 1일간 배양한다.
6. 400 nm에서 흡광도 측정하여 Melanin 함량을 구한다.
결과해석
시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 멜라닌 생성 저해율을 나타낸다.
   % inhibition = [(A-B)/A] ⅹ100
   A : 시험물질(inhibitor)을 첨가한 배지에서 배양한 세포의 흡광도
   B : 시험물질을 첨가하지 않은 조건에서 배양한 세포의 흡광도
참고문헌 1. 고주영, 김영철, 삼릉 에탄올추출물의 in vitro 피부 미백 유효성, 환경독성보건학회지, 25(1) p69-77, 2010
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제목 Melan-a세포에서 멜라닌 생성 측정법 링크 자외선에 의한 피부보호
실험재료
필요장비 및 소모품
Inverted microscope (범용), 세포 배양기 (범용), 원심분리기 (범용), Cell culture dish (Falcon), Sepctrophotometer
 
필요시약
RPMI-1640(Thermo), Fetal bovine serum(FBS) (Gibco), Penicillin/streptomycin (Gibco), 0.5% Trypsin-EDTA (gibco), Phosphate buffer saline (PBS) (바이오세상), TPA 200 nM
 
실험방법
1. Melan-a 세포를 10% FBS, 1% P/S, TPA 200 nM 가 함유된 RPMI-1640 배지에 푼다.
2. 37, 5% CO2 incubator에서 48시간 동안 안정화 시킨다.
3. 안정화 된 Melan-a 세포를 96-well plate에 적정세포수 (2×10^4 cells/well)로 분주한다.
4. 37, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한다.
5. 샘플을 농도별(50, 100, 150, 200 ppm)로 희석시켜 200μL씩 넣는다.
6. 37, 5% CO2 incubator에서 72시간 배양한다.
7. 2차 물질 처리한다.
8. 72시간 배양한다.
9. 배양이 끝난 후 1 N NaOH 용액으로 멜라닌을 용해시킨다.
10. Sepctrophotometer490 nm에서 흡광도를 측정한다.
11. 다음과 같은 식으로 멜라닌을 산출한다.
멜라닌 양(%) = (시료 첨가구의 흡광도 / 시료 무 첨가구의 흡광도) X 100
실험결과 예
1.jpg
출처 : 고주영 et al., 2010
결과해석
Melan-a세포에 시료(SREE)를 농도별로 처리 한 후 멜라닌의 양을 측정한 결과, 시료를 처치하지 않은 정상군에 비해 양성대조군인 PC150 ppm에서 멜라닌 함량이 59.1% 감소하였고, 시료(SREE) 처리군의 멜라닌 양은 농도의존성 부적(-) -반응 관계를 보였으며 정상군에 비해 50, 100, 150, 200 ppm에서 각각 22.3%, 36.2%, 43.2%, 47.0% 감소하였다.
참고문헌 1. 고주영, 김영철, 삼릉 에탄올추출물의 in vitro 피부 미백 유효성, 환경독성보건학회지, 25(1) p69-77, 2010
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