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피부건강

시험관내 및 세포실험법

제목 인간 진피 섬유아세포에서 MMP-1 효소 활성 저해 효능 측정
구분 피부건강 링크 자외선에 의한 피부보호
실험배경
실험재료
필요장비 및 소모품
non-binding surface plate, Fluoresence microplate reader, pipettes, 1.5ml tube, aluminum foil
 
필요시약
MMP-1 assay kit (Anaspec) 
세포주
Human dermal fibroblasts 
실험방법
1. conditioned media를 획득하여 1000rcf 10~15분간 4℃에서 centrifuge 한다.
2. 상층액을 취한 뒤, APMA의 농도가 1mM이 되도록 넣고 37℃에서 3시간 incubation 시킨다.
3. MMP-1 효소가 activation된 media를 non-binding surface plate에 50ul씩 넣는다.
4. MMP-1 substrate를 50ul씩 넣는다.
5. 알루미늄호일로 빛을 차단한 후, 30초간 shaker에서 반응시킨다.
6. 다시 37℃에서 1시간 incubation하여 기질과 효소를 반응시킨다.
7. stop solution을 50ul씩 넣고 반응을 종료시킨다.
8. 형광현미경으로 Ex/Em=490nm/520nm로 형광을 읽는다.
9. Data를 정리한다.
결과해석
UVB만 조사한 대조군을 기준으로 시험물질을 처리한 실험군에서 농도 의존적으로 효소활성이 감소함을 알 수 있다.
참고문헌 1. Bo-Mi Hwang, Eun-Mi Noh, Jong-Suk Kim, Jeong-Mi Kim, Jin-Ki Hwang, Hye-Kyung Kim, Jae-Seon Kang, Do-Sung Kim, Han-Jung Chae, Yong-Ouk You, Kang-Beom Kwon, Young-Rae Lee, Decursin inhibits UVB-induced MMP expression in human dermal fibroblasts via regulation of nuclear factor-κB, INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR MEDICINE, 31() p477-483, 2013
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제목 인간 진피 섬유아세포에서 MMP-1 효소 활성 저해 효능 측정 링크 자외선에 의한 피부보호
실험재료
필요장비 및 소모품
non-binding surface plate, Fluoresence microplate reader, pipettes, 1.5ml tube, aluminum foil
 
필요시약
MMP-1 assay kit (Anaspec) 
실험방법
1. 6 well dish에 각 군당 3개씩 시험할 수 있도록 세포를 동일한 수로 배양한다.
2. serum free media로 starvation을 24시간 수행한다.
3. 시험물질 처리 1시간 후에 UVB 0.02J/cm2을 조사한다.
4. UVB 조사 48시간 뒤에 conditioned media를 회수한다.
5. media를 1.5ml tube에 넣고, 1000rcf 10~15분간 4℃에서 centrifuge 한다음, 상층액만 회수한다.
6. 회수한 상층액 부피에서 APMA의 농도가 1mM이 되도록 넣고 37℃에서 3시간 incubation 하여 MMP-1 효소를 활성화 시킨다.
7. 활성화된 MMP-1 효소가 들어있는 media를 non-binding surface plate에 50ul씩 넣는다.
8. MMP-1 substrate를 50ul씩 넣는다.
9. 알루미늄호일로 빛을 차단한 후, 30초간 shaker에서 반응시킨다.
10. 다시 37℃에서 1시간 incubation하여 기질과 효소를 반응시킨다.
11. stop solution을 50ul씩 넣고 반응을 종료한다.
12. 형광현미경으로 Ex/Em=490nm/520nm로 형광을 읽는다.
13. Data를 정리한다.
실험결과 예
1.jpg
결과해석
UVB만 조사한 대조군 대비 무처리군, 시험물질 처리군의 효소활성 저해도를 평가한다. A물질의 경우 무처리군 수준으로 효소활성이 감소됨을 확인할 수 있으므로, B, C 소재보다 효능이 우수함을 알 수 있다.
참고문헌
첨부파일
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