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피부건강

시험관내 및 세포실험법

제목 인간 진피 섬유아세포에서 HYAL1 유전자 발현 측정
구분 피부건강 링크 피부보습
실험배경
피부노화는 시간의 경과에 따라 자연적으로 일어나는 내재적 노화와 햇빛이나 대기오염 같은 외부 요인에 의해 발생하는 외재적 노화로 나뉜다. 인간의 피부는 크게 표피층 (Epidermis)와 진피층 (Dermis)로 구성되어 있는데 시간에 경과에 따라 피부 노화가 진행되면 그 결과로 콜라겐이 감소하고 피부 탄력이 떨어지며 수분 손실이 증가한다. 따라서 천연 보습인자인 히알루론산 (Hyaluronan)과 같은 피부 보습 인자를 증가시키는 것은 피부 수분을 보존하고 노화를 예방하는 좋은 전략이 될 수 있다.
항피부노화 효능 평가 연구를 위해서는 인간 진피 섬유아세포인 Human dermal fibroblast을 이용하는데 이는 배양조건이 까다롭지 않고 실제로 인간을 대상으로 하는 in vitro 실험에 적합하다.
이 인간 진피 섬유아세포에 후보 물질을 처리하여 히알루론산의 가수분해 효소인 hyaluronidase1 (hyal1) 의 mRNA를 real-time PCR로 측정하면 된다. 항노화의 효능평가에 대한 Hyal1의 발현정도측정은 직접적인 효능평가 플랫폼 기술이라 할 수 있다.
실험재료
필요장비 및 소모품
도립현미경 (Inverted microscope), 배양기, 원심분리기, cell culture dish, Real time PCR system 
필요시약
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), Fetal bovine serum (FBS), Penicillin/streptomycin, 0.5% Trypsin-EDTA, Phosphate buffer saline (PBS), RNAiso plus, Chloroform, Isopropanol, cDNA synthesis kit, TRIzol reagent, human β-actin primer/probe reagent, TaqMan Universal PCR Mix 
세포주
Human dermal fibroblast 
실험방법
1. HDF 세포를 배양용 DMEM 배지로 6 cm에 배양한다.
2. 세포가 플레이트에 빽빽하게 차면 Serum-free media로 교환하여 24시간 동안 starvation 해준다.
3. 측정하고자 하는 시료를 설정된 다양한 농도로 dish에 첨가한 후 3시간 동안 배양한다.
4. 시험물질에 노출시킨 세포를 TRIzol reagent를 이용하여 RNA를 추출한 후 정량한다.
5. RNA(2 μg)에 oligo(dT) primer를 사용하여 cDNA를 합성한다.
6. human Hyal1의 primer sequence는 다음과 같다. (LI et al., 2007)
Forward: 5’-GATGTCAGTGTCTTCGATGTGGTA-3’
Reverse: 5’-GGGAGCTATAGAAAATTGTCATGTCA-3’
7. 1X SYBR Green PCR Master Mix, cDNA, primers, 그리고 RNase-free water를 넣는다. 반응 혼합액의 준비는 다음과 같다; 10 μl 1X SYBR Green PCR Master Mix, 1 μl Forward primer (20 μM), 1 μl Reverse primer (20 μM), 3 μl cDNA, 5 μl RNase-free water, 총 반응액 부피 20 μl.
8. PCR 증폭은 다음과 같이 실행한다: 50℃ for 2 min, 45 cycles (15s each) at 95℃ & 55℃ for 1min.
9. 이 실험에서와 같이 Taqman이 아닌 SYBR Green으로 PCR을 한 경우에는, primer dimer의 부재를 확인하고 정확한 산물이 증폭되었는지를 보기 위해 melting curve를 분석한다. Sequence Detector software를 사용하여 Amplification data를 분석한다. Relative mRNA expression 수준은 mathmatical formulas (2 -△△Ct)를 사용하여 분석한다.
10. RT-PCR 결과의 통계처리는 평균 normalized cycle threshold (△Ct) 값과 표준편차 값을 구하고, one-way ANOVA로 분석한 후에 p<0.05 수준에서 유의성을 t-test로 검증한다.
결과해석
1.jpg
Hyal1은 히알루론산의 분해효소로 피부 보습에 중요한 역할을 하므로, Hyal1 mRNA가 적을수록 피부 보습력이 높아진다고 판단할 수 있다. 위의 그래프에서 open bar는 sample을 처리하지 않은 군, closed bar는 sample을 처리한 군으로  sample 처리가 Hyal1의 발현을 낮추었다는 것을 알 수 있다.
참고문헌 1. Lingli LI*, Trias ASTERIOU*, Berit BERNERT*, Carl-Henrik HELDIN* and Paraskevi HELDIN*†1, Growth factor regulation of hyaluronan synthesis and degradation in human dermal fibroblasts: importance of hyaluronan for the mitogenic response of PDGF-BB, Biochemical Journal, 404() p327-336, 2007
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제목 인간 진피 섬유아세포에서 HYAL1 유전자 발현 측정 링크 피부보습
실험재료
필요장비 및 소모품
Real time PCR system(Applied Biosystem(271000310)) 
필요시약
TRIzol reagent(Life Technologies), human β-actin primer/probe reagent(Applied Biosystems; Cat. # 431088IE), TaqMan Universal PCR Mix(Applied Biosystem; Cat. # 4304437) 
실험방법
1. 다양한 농도의 시험물질에 노출시킨 세포를 TRI Reagent(Molecular Research Centr, Inc.) 또는 TRIzol reagent(Life Technologies)를 이용하여 RNA를 추출한 후 정량한다.
2. Hyal1 primer 디자인
 
Forward: 5’-GATGTCAGTGTCTTCGATGTGGTA-3’
Reverse: 5’-GGGAGCTATAGAAAATTGTCATGTCA-3’
Probe: 6FAM-TGCAACACAGCAACCAGAAACTCAAGCA-TAMRA
β-actin는 5‘-end에 reporter dye VICTM으로 표지된 것을 Applied Biosystem에서 구입하여 사용한다.
 
3. cDNA를 합성은 ABI model 7700 Sequence Detector (Applied Biosystem)을 이용하여 수행한다. PCR product (25 μl final volume)에는 0.3 μM의 Hyal1 primer, 0.2 μM의 cognate Taqman probe, 1.25 μl의 human β-actin primer/probe reagent (Applied Biosystems; Cat. # 431088IE), 그리고 12.5 μl의 TaqMan Universal PCR Mix (Applied Biosystem; Cat. # 4304437)가 포함된다. 반응 혼합물을 50℃에서 2분간 미리 가열해 둔다.
4. PCR 프로그램은 95℃에서 Taq Gold activation을 10분한 후 95℃에서 15초, 60℃에서 1분을 45회 반복한다.
5. 각 시료에서 RNA 20 ng에 대한 human cDNA equivalent를 분석한다. PCR cycle 수는 threshole detection line에 도달한 수로 결정한다 (Ct value). cDNA 시료는 2-6회 정도 반복하여 분석하여 분석의 타당성을 체크한다. ΔCt는 다음과 같이 계산한다.
ΔCt = [Ct(ACAT1 또는 2}-Ct(β-actin)]
6. ACAT-1과 ACAT-2의 상대적인 비는 다음과 같이 계산한다.
ΔΔCt = ΔCt(ACAT-2) - ΔCt(ACAT-1)
Ratio (ACAT-2)/ (ACAT-1) = 2-ΔΔCt
7. RT-PCR 결과의 통계처리는 평균 normalized cycle threshold (△Ct) 값 또는 ΔΔCt과 표준편차 값을 구하고, one-way ANOVA로 분석한 후에 p<0.05 수준에서 유의성을 t-test로 검증한다.
실험결과 예
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 출처 : Lingli LI et al., 2007
결과해석 Hyal1은 히알루론산의 분해효소로 피부 보습에 관여하는 핵심 조절인자로 작용하는 역할을 한다. Sample A의 농도가 증가할수록 Hyal1 mRNA의 양이 감소하였으므로 이 Sample 은 농도 의존적으로 피부 보습 효과를 나타낸다고 할 수 있다.
참고문헌 1. Lingli LI*, Trias ASTERIOU*, Berit BERNERT*, Carl-Henrik HELDIN* and Paraskevi HELDIN*†1, Growth factor regulation of hyaluronan synthesis and degradation in human dermal fibroblasts: importance of hyaluronan for the mitogenic response of PDGF-BB, Biochemical Journal, 404() p327-336, 2007
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