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피부건강

시험관내 및 세포실험법

제목 인간 진피 섬유아세포에서 MMP-1 유전자 발현 측정
구분 피부건강 링크 자외선에 의한 피부보호
실험배경
피부는 크게 표피층(epidermis), 진피층(dermis), 피하조직층(subcutaneous layer)으로 구분할 수 있는데 이 중 피부의 표피층은 끊임없이 재생되어 떨어져 나가는데 비해 진피층은 섬유성분과 기질성분으로 구성되어 있으며 진피에 분포하는 모세혈관과 신경이 표피에 영양분을 보충해 주므로 피부의 노화와 밀접한 관련이 있다.
피부주름은 UVB와 같은 외부요인에 의해 피부 구조를 유지하는 섬유아 세포가 파괴되거나 피부 진피층의 70% 이상을 차지하여 피부 항상성을 유지하는 콜라겐과 탄력섬유의 합성이 감소되고 세포 외 기질단백질의 분해 효소인 Matrix metalloproteinases(MMPs)의 발현이 증가한다. 따라서 피부 진피층의 섬유 아세포의 과다한 기질분해 효소를 억제하고 콜라겐 전구체의 발현을 조절하는 것은 여러 자극에 대한 피부건강을 유지하는데 중요한 지표가 될 수 있다.
항노화에 대한 효능 평가를 위한 방법으로는 후보물질을 인간 진피 섬유 아세포주인 HDF에 처리하여 유도된 MMP-1(Matrix metalloproteinase-1)의 유전자 발현 역제 효과를 들 수 있다.
대상 세포주인 HDF는 인간 진피 섬유 아세포로서 진피 윗부분에 주로 많이 분포하며 콜라겐, 탄력섬유, 글리코스아미노글리칸과 같은 구조물질을 합성한다. 다른 피부 세포 주들에 비해 제한된 계대수(Passage number)를 가지기 때문에 주기적으로 세포를 교환해야 하지만 인간 진피층에서 분리한 세포이기 때문에 in vitro에서 주름과 관련된 실험을 하기에는 가장 적합한 세포 주이다.
실험재료
필요장비 및 소모품
도립현미경 (Inverted microscope), 배양기, 원심분리기, cell culture dish, Real time PCR system 
필요시약
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), Fetal bovine serum (FBS), Penicillin/streptomycin, 0.5% Trypsin-EDTA, Phosphate buffer saline (PBS), RNAiso plus, Chloroform, Isopropanol, cDNA synthesis kit, TRIzol reagent, human β-actin primer/probe reagent, TaqMan Universal PCR Mix 
세포주
Human dermal fibroblast 
실험방법
1. HDF 세포를 배양용 DMEM 배지로 6 cm에 배양한다.
2. 세포가 플레이트에 빽빽하게 차면 Serum-free media로 교환하여 24시간 동안 starvation 해준다.
3. 측정하고자 하는 시료를 설정된 다양한 농도로 dish에 첨가한 후 10시간 동안 배양한다.
4. 시험물질에 노출시킨 세포를 TRIzol reagent를 이용하여 RNA를 추출한 후 정량한다.
5. RNA(2 μg)에 oligo(dT) primer를 사용하여 cDNA를 합성한다.
6. human MMP-1 의 primer sequence는 다음과 같다. (Kim et al., 2009))
 
forward : 5’-AAGCGTGTGACAGTAAGCTA-3’
reverse : 5’-AACCGGACTTCATCTCTG-3’
 
7. 1X SYBR Green PCR Master Mix, cDNA, primers, 그리고 RNase-free water를 넣는다. 반응 혼합액의 준비는 다음과 같다; 10 μl 1X SYBR Green PCR Master Mix, 1 μl Forward primer (20 μM), 1 μl Reverse primer (20 μM), 3 μl cDNA, 5 μl RNase-free water, 총 반응액 부피 20 μl.
8. PCR 증폭은 다음과 같이 실행한다: 50℃ for 2 min, 45 cycles (15s each) at 95℃ & 55℃ for 1min.
9. 이 실험에서와 같이 Taqman이 아닌 SYBR Green으로 PCR을 한 경우에는, primer dimer의 부재를 확인하고 정확한 산물이 증폭되었는지를 보기 위해 melting curve를 분석한다. Sequence Detector software를 사용하여 Amplification data를 분석한다. Relative mRNA expression 수준은 mathmatical formulas (2 -△△Ct)를 사용하여 분석한다.
10. RT-PCR 결과의 통계처리는 평균 normalized cycle threshold (△Ct) 값과 표준편차 값을 구하고, one-way ANOVA로 분석한 후에 p<0.05 수준에서 유의성을 t-test로 검증한다.
결과해석 MMP-1 mRNA 발현이 감소 할 수록 피부 주름 개선에 효과가 있다고 할 수 있다.
참고문헌 1. Bo-Mi Hwang, Eun-Mi Noh, Jong-Suk Kim, Jeong-Mi Kim, Jin-Ki Hwang, Hye-Kyung Kim, Jae-Seon Kang, Do-Sung Kim, Han-Jung Chae, Yong-Ouk You, Kang-Beom Kwon, Young-Rae Lee, Decursin inhibits UVB-induced MMP expression in human dermal fibroblasts via regulation of nuclear factor-κB, International Journal of Molecular Medicine, 31(2) p477-483, 2012
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제목 인간 진피 섬유아세포에서 MMP-1 유전자 발현 측정 링크 자외선에 의한 피부보호
실험재료
필요장비 및 소모품
Real time PCR system(Applied Biosystem(271000310)) 
필요시약
TRIzol reagent(Life Technologies), human β-actin primer/probe reagent(Applied Biosystems; Cat. # 431088IE), TaqMan Universal PCR Mix(Applied Biosystem; Cat. # 4304437) 
실험방법
1. 다양한 농도의 시험물질에 노출시킨 세포를 TRI Reagent(Molecular Research Centr, Inc.) 또는 TRIzol reagent(Life Technologies)를 이용하여 RNA를 추출한 후 정량한다.
2. MMP-1 primer 디자인
 
forward : 5’-AAGCGTGTGACAGTAAGCTA-3’
reverse : 5’-AACCGGACTTCATCTCTG-3’
β-actin는 5‘-end에 reporter dye VICTM으로 표지된 것을 Applied Biosystem에서 구입하여 사용한다.
 
3. cDNA를 합성은 ABI model 7700 Sequence Detector (Applied Biosystem)을 이용하여 수행한다. PCR product (25 μl final volume)에는 0.3 μM의 MMP-1 primer, 0.2 μM의 cognate Taqman probe, 1.25 μl의 human β-actin primer/probe reagent (Applied Biosystems; Cat. # 431088IE), 그리고 12.5 μl의 TaqMan Universal PCR Mix (Applied Biosystem; Cat. # 4304437)가 포함된다. 반응 혼합물을 50℃에서 2분간 미리 가열해 둔다.
4. PCR 프로그램은 95℃에서 Taq Gold activation을 10분한 후 95℃에서 15초, 60℃에서 1분을 45회 반복한다.
5. 각 시료에서 RNA 20 ng에 대한 human cDNA equivalent를 분석한다. PCR cycle 수는 threshole detection line에 도달한 수로 결정한다 (Ct value). cDNA 시료는 2-6회 정도 반복하여 분석하여 분석의 타당성을 체크한다. ΔCt는 다음과 같이 계산한다.
ΔCt = [Ct(ACAT1 또는 2}-Ct(β-actin)]
6. ACAT-1과 ACAT-2의 상대적인 비는 다음과 같이 계산한다.
ΔΔCt = ΔCt(ACAT-2) - ΔCt(ACAT-1)
Ratio (ACAT-2)/ (ACAT-1) = 2-ΔΔCt
7. RT-PCR 결과의 통계처리는 평균 normalized cycle threshold (△Ct) 값 또는 ΔΔCt과 표준편차 값을 구하고, one-way ANOVA로 분석한 후에 p<0.05 수준에서 유의성을 t-test로 검증한다.
실험결과 예
 
결과해석 MMP-1 mRNA의 발현양이 적을수록 기능성 소재의 피부 주름 개선 효능이 높다고 판단할 수 있다. 이 Sample A 는 그 농도가 증가함에 따라 MMP-1 mRNA 발현 양이 감소하였으므로 피부 주름 개선에 도움이 된다고 말할 수 있다.
참고문헌 1. Bo-Mi Hwang, Eun-Mi Noh, Jong-Suk Kim, Jeong-Mi Kim, Jin-Ki Hwang, Hye-Kyung Kim, Jae-Seon Kang, Do-Sung Kim, Han-Jung Chae, Yong-Ouk You, Kang-Beom Kwon, Young-Rae Lee, Decursin inhibits UVB-induced MMP expression in human dermal fibroblasts via regulation of nuclear factor-κB, International Journal of Molecular Medicine, 31(2) p477-483, 2012
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