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피부건강

시험관내 및 세포실험법

제목 인간 진피 섬유아세포를 이용한 HYAL1 단백질 발현 측정
구분 피부건강 링크 피부보습
실험배경
피부노화는 시간의 경과에 따라 자연적으로 일어나는 내재적 노화와 햇빛이나 대기오염 같은 외부 요인에 의해 발생하는 외재적 노화로 나뉜다. 인간의 피부는 크게 표피층 (Epidermis)와 진피층 (Dermis)로 구성되어 있는데 시간에 경과에 따라 피부 노화가 진행되면 그 결과로 콜라겐이 감소하고 피부 탄력이 떨어지며 수분 손실이 증가한다. 따라서 천연 보습인자인 히알루론산 (Hyaluronan)과 같은 피부 보습 인자를 유지하거나 증가시키는 것은 피부 수분을 보존하고 피부 건강에 도움을 줄 수 있다
피부건강 효능 평가 연구를 위해서는 인간 진피 섬유아세포인 Human dermal fibroblast을 이용하는데 이는 배양조건이 까다롭지 않고 실제로 인간을 대상으로 하는 in vitro 실험에 적합하다.
이 인간 진피 섬유아세포에 후보 물질을 처리하여 히알루론산의 가수분해 효소인 hyaluronidase1 (HYAL1) 의 단백질 발현을 western blot으로 측정한다.
실험재료
필요장비 및 소모품
도립현미경 (Inverted microscope), 세포 배양기, 원심분리기, SDS-PAGE-전기영동장치, Transfer 장치, Cell culture dish, X-ray film, Cassette, PVDF membrane, Agfa medical X-ray film, OHP film
 
필요시약
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Fetal bovine serum (FBS), Penicillin/streptomycin, Trypsin-EDTA, Phosphate buffer saline (PBS), DC Protein assay, PROTEIN-transfer buffer, cell lysis buffer (10X), ECL plus reagent, Skim milk, Tris buffer with Tween 20 (TBST), HAS2 rabbit polyclonal antibody, Monoclonal anti0actin, goat anti-rabbit IgG-HRP, Goat Anti-Mouse IgG (H+L), HRP Conjugate, VIVID developer, VIVID fixer, methyl alcohol 
세포주
Human dermal fibroblast 
실험방법
1. 세포를 적정한 수로 dish 에 배지와 함께 넣어 배양한다.
2. 세포가 dish 에 가득 차면 serum-free 배지로 24시간 starvation 한다.
3. Sample 을 포함한 배지로 바꿔서 sample 을 처리한 후 3시간 동안 배양한다.
4. Cell lysis 후 단백질 양을 정량하여 SDS sample buffer 에 동량을 섞어준다.
5. 5분간 heat boiling 해준 후 얼음에서 냉각해준다.
6. 10 % SDS-polyacrylamide gel loading PVDF membrane 으로 transfer 한다.
7. Membrane 5% skim milk solution 2시간 blocking 을 해준 후 5% skim milk 에 희석된 HYAL1 antibody4overnight 해준다.
8. TBST solution30분간 shaking washing 을 해준 후 2antibody 를 붙여준다.
9. 암실에서 ECL plus solution 을 이용하여 반응을 시켜주며 western blot film에 결과를 도출해낸다.
결과해석
Western blotting 기법을 이용하여 HYAL1 의 발현을 확인하는 실험으로 film band 형태로 HYAL1 의 발현이 나타나게 된다. 따라서 HYAL1 band intensity를 통해 HYAL1 의 발현양을 확인할 수 있다. HYAL1는 히알루론산 분해효소로 피부 보습에 중요한 역할을 하므로, HYAL1의 발현량이 낮을 수 록 피부 보습력 유지가 높아진다고 판단할 수 있다.
참고문헌 1. Lingli LI*, Trias ASTERIOU*, Berit BERNERT*, Carl-Henrik HELDIN* and Paraskevi HELDIN*†1, Growth factor regulation of hyaluronan synthesis and degradation in human dermal fibroblasts: importance of hyaluronan for the mitogenic response of PDGF-BB, Biochemical Journal, 404() p327-336, 2007
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제목 인간 진피 섬유아세포를 이용한 HYAL1 단백질 발현 측정 링크 피부보습
실험재료
필요장비 및 소모품
도립현미경 (Inverted microscope), 세포 배양기, 원심분리기, SDS-PAGE-전기영동장치, Transfer 장치, Cell culture dish, X-ray film, Cassette, PVDF membrane, Agfa medical X-ray film, OHP film
 
필요시약
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Fetal bovine serum (FBS), Penicillin/streptomycin, Trypsin-EDTA, Phosphate buffer saline (PBS), DC Protein assay, PROTEIN-transfer buffer, cell lysis buffer (10X), ECL plus reagent, Skim milk, Tris buffer with Tween 20 (TBST), HYAL1 rabbit polyclonal antibody, Monoclonal anti0actin, goat anti-rabbit IgG-HRP, Goat Anti-Mouse IgG (H+L), HRP Conjugate, VIVID developer, VIVID fixer, methyl alcohol 
실험방법
1. 배지조성
배양용 배지 : DMEM 배지 450 mL에 FBS 50 mL, Antibiotic (Strep./Peni.) 1mL을 각 농도에 맞게 첨가하여 잘 흔들어준 후 24시간 정치 후 사용한다.
Serum-free 배지 : DMEM 배지에 Antibiotic (Strep./Peni.) 1mL을 각 농도에 맞게 첨가하여 잘 흔들어준 후 24시간 정치 후 사용한다.
 
2. 세포 배양, 시료 처리, 단백질 prep
1) 무균작업대에서 6 cm 배양 접시에 cell을 1 x 10^5개 seeding한 후 48시간 후에 serum starvation을 24시간 한다.
2) Serum starvation된 세포에 처리할 시료를 starvation 배지에 적정 농도로 섞은 후 배양기에서 3시간 동안 배양한다.
3) 배지를 suction 한 후 Cold PBS 2 ml로 2번 washing 해 준다.
4) 남아 있는 PBS를 완전히 제거한 후 cell lysis buffer 80 ul 를 넣고 얼음판 위에 올려놓는다.
5) 얼음 위에서 scraper를 이용하여 6 cm 배양 접시의 세포를 긁어 모아 tube에 담아 얼음에서 10 분에 한번씩 총 3번 vortexing 해준다.
6) 14000 rpm, 10 min 으로 centrifuge 해 배지 안의 죽은 세포를 침전시킨 후 상층액을 다른 tube로 옮긴다.
 
3. Loading, Blotting
1) 농축된 배지의 단백질 양을 DC protein assay kit을 이용하여 정량하여 SDS sample buffer에 동량을 섞어준다.
2) 5분간 95℃에서 Heat boiling해준 후 얼음에서 냉각해준다.
3) 10% SDS-polyacrylamide gel에 Loading 하고 90V 20분, 110V로 90분 전기영동한다.
TIps:
- 10 % SDS-polyacrylamide gel 만드는 법
PROTEIN-PAGE-10% 용액 : APS : TEMED = 8 mL : 40 uL : 8 uL의 비율로 50 mL tube에 담아 잘 섞은 후 casting에 넣는다. Gel 넣고 70% 에탄올을 채워준다. Gel이 굳으면 70% 에탄올을 버리고 comb을 꽂는다. 5% stacking gel (PROTEIN-PAGE-5% stacking gel 용액 APS : TEMED = 4 mL : 50 uL : 4 uL)을 1000 uL pipette을 사용하여 comb 사이로 넣어주어 gel을 굳힌다.
 
4. 전기영동이 끝나면 젤을 메탄올에 activation 시킨 PVDF membrane으로 transfer한다.
Tips:
- Transfer 방법
<스폰지-3M paper-PVDF membrane-gel-3M paper-스폰지>의 형태로 샌드위치 모양을 만든 후, Transfer buffer를 충분히 적신 후 90~110 mA로 100~120분 transfer 한다.
 
5. PVDF Membrane을 메탄올에 담궈 activation 시킨 후 5% skim milk (Skim milk 25 g + 500 ml TBST)에 2시간 blocking 을 해준다.
6. HYAL1 antibody를 5% skim milk-TBST solution에 1:1000 배수로 희석한 용액에 PVDF membrane를 담가 4℃에서 overnight으로 gently shaking한다.
7. TBST solution으로 10분씩 세 번 washing을 해준다.
8 2차 anti rabbit antibody를 5% skim milk에 1:5000 배수로 희석한 후, 상온에서 1시간 동안 붙여준다.
9. 2차 antibody를 붙인 후 TBST solution으로 10분씩 세 번 washing 해준다.
10. Film 현상
Tips:
- Developer, Fixer, 카세트, membrane 당 2개의 OHP film, ECL plus, pipetter, 물통을 준비한다.
1) 암실에서 문을 잠그고 불 켠 채로 카세트를 꺼낸다.
2) 카세트 안을 깨끗이 닦은 후 OHP film을 깐다.
3) 불을 끄고 developer와 fixer를 각각의 통에 넣는다.
4) E-tube에 ECL + A 500 ul와 B 12.5 ul를 섞는다.
5) 폐액통에 TBST 용액을 완전히 털어 버린 후 e-tube에 섞어 놓은 reagent를 membrane에 골고루 뿌려준다.
6) 핀셋으로 끝에 잡아 OHP film위에 올리고 다른 OHP film으로 덮고 핸드타올로 기포를 제거한다.
7) 그 위에 AGFA film을 올리고 카세트를 닫는다.
8) 카세트를 열어 AGFA film을 꺼내 developer 통에 담궈 현상하고 fixer에 담근다.
9) 불을 켜기 전에 developer, AGFA film, ECL + 용액을 정리 한다.
10) 나온 film들을 가지고 간 물통에 옮겨 담아서 나온다.
실험결과 예
1.jpg


결과해석 Western blotting을 통해 HYAL1의 발현양 변화를 확인할 수 있다. 참고문헌에서 sample을 처리한 HYAL1 band를 찾을 수 없어 시간에 따른 HYAL1 band를 예시로 나타내었고, sample 처리시 Control에 비해 기능성 소재 물질을 처리한 실험군에서 HYAL1의 발현이 감소할 것으로 예상된다.
참고문헌
첨부파일
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