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피부건강

시험관내 및 세포실험법

제목 B16 쥐 흑색종 세포에서 세포독성 측정(MTT assay)
구분 피부건강 링크 기초실험법
실험배경
피부의 색소침착은 다양한 환경적인 요인(자외선, 성장인자, 염증관련 mediator, DNA 손상, 활성산소 )에 의해 발생되며, 이때 멜라노사이트(melanocyte)내 tyrosinase가 주 역할을 하는 것으로 알려져 있다.  따라서, 많은 선행연구들은 melanoma 세포를 활용하여 시험물질의 tryosinase 활성 저해 및 melanin 형성 억제 효과 등을 평가하고 있다. 이때, 시험물질이 세포생존율에 영향을 미치는지에 대한 확인이 먼저 이루어져야 하며, 이를 확인하기 위해 MTT assay를 할 수 있다.  
실험재료
필요장비 및 소모품
도립현미경(Inverted microscope), 무균작업대(Clean bench), 항온수조(Water bath), 세포 배양기(CO₂ incubator), 원심분리기(Centrifuge), 96-well plate, 1회용 pipette(10 ml), pipet aid, cell counter
 
필요시약
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Fetal Bovine Serum (FBS), 0.5% trypsin-EDTA, Penicillin/streptomycin, Phosphate buffer saline (PBS), MTT powder, Dimethyl sulfoxide(DMSO)
 
세포주
B16-F10 murine melanoma
 
실험방법
1. 96-well plate200 μL씩 세포를 seeding한다.
2. 70~80% 정도 세포가 자라면 시료와 α-MSH를 농도별로 처리 후 48시간 동안 배양한다.
3. 배양 후, MTT solution을 각 well20 μl씩 첨가 후 2시간 동안 다시 배양한다.
4. 배지를 모두 제거한 후 DMSO를 각 well200 μl씩 첨가 한다
5. 30분 동안 shaking시킨다.
6. Microplate leader를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정한다.
결과해석
살아있는 세포가 많을 수록 formazan 형성도 많아질 것이며, 그 값을 측정함으로써 세포생존율을 측정할 수 있다. 흡광도는 MTT가 세포에 의해 환원된 양을 나타내며 ,각 well에 존재하는 생존 세포 수와 비례한다.
참고문헌 1. 이용수, B16 흑색종세포에서 로바스타틴에 의한 멜라닌 합성 촉진효과에 미치는 세포내 칼슘의 역할, 약학회지, 57(1) p24-31, 2013
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제목 B16 쥐 흑색종 세포에서 세포독성 측정(MTT assay) 링크 기초실험법
실험재료
필요장비 및 소모품
도립현미경(Olympus), 무균작업대(수공테크), 항온수조(대일화학), 원심분리기(Sorvall fresco), 세포배양용 플레이트(96 well plate, SPL), 세포배양기(Thermo scientific), Microplate reader(Biorad, 168-1130), 1회용 pipette(10 ml, BD falcon), pipette(Thermo scientific), pipette tip(QSP), cell counter(Invitrogen), Syringe filter 0.20, 25mm (adventec)
 
필요시약
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) (Thermo), Fetal bovine serum (FBS) (Thermo), Penicillin/streptomycin (Welgene), Trypsin 0.25%-EDTA (Biowest), Phosphate buffer saline (PBS) (바이오세상), 3-(4,5-dimethylthiaxo-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT, Sigma), α-Melanocyte Stimulating Hormone (MSH, Sigma), Dimethyl sulfoxide (DMSO, JUNSEI)
 
실험방법 1. 배지 제조
배양용 배지 : DMEM배지 450 ml에 10% FBS 50 ml, 0.2% Antibiotic(Strep./Peni.) 1 ml을 각 농도에 맞게 첨가하여 잘 흔들어 준 후 사용한다.
 
2. 실험방법
1) B16/F10 흑색종 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM(GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA)를 이용하여 2.0×104 cells/mL로 96 well plate에 넣고 24시간 배양 한다.
2) 시료와 α-MSH 50 nM을 동시에 처리하고 24시간 배양한다.
Tips:
- s a-MSH는 멜라노사이트에 있는 melanocortin-1(MC-1) 수용체에 결합하여 cAMP 활성을 증가시켜 멜라닌 생성을 촉진시키는 역할을 한다.
3) MTT 용액 50 μL를 첨가하여 4시간 동안 반응시킨다.
4) 배양배지를 완전히 제거하고 dimethylsulfoxide(DMSO; Sigma, St. Luois, MO, USA)를 200 uL를 가한다
5) 30분동한 shaking 하여 침전물을 완전히 용해시킨다.
6) Microplate reader를 사용하여 540 nm 흡광도를 측정한다.  a-MSH는 멜라노사이트에 있는 melanocortin-1(MC-1) 수용체에 결합하여 cAMP 활성을 증가시켜 멜라닌 생성을 촉진시키는 역할을 한다.
실험결과 예
출처 : Wu Li et al., 2011
결과해석
시험물질  0.2 mg/mL 부터 세포생존율이 유의적으로 감소하여 세포독성이 있는 것으로 판단되며, 이후 실험에서는 독성을 나타내지 않는 농도에서 수행되어야 한다.
참고문헌 1. Wu Li, Lin Y, Antimelanogenic effect of c-phycocyanin through modulation of tyrosinase expression by upregulation of ERK and downregulation of p38 MAPK signaling pathways, J Biomed Sci, 18() p74, 2011
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