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피부건강

시험관내 및 세포실험법

제목 인간 표피 각화세포에서 c-Jun/p-c-Jun 단백질 발현 측정
구분 피부건강 링크 자외선에 의한 피부보호
실험배경
(Yolanda Rosi Helfrich et al., 2008)
[그림] 자외선에 대한 주요한 전사인자
콜라겐은 인간피부의 탄력과 강도를 유지하는 주요한 요소 중 하나이다
. 세포성장, 분열, 염증 등을 조절하는 주요한 전사인자인 AP-1, 자외선에 의해 그 활성이 증가되어 콜라겐 분해효소인 MMP-1 발현을 증가시킨다. 이는 진피층에 존재하는 콜라켄을 분해하여 주름을 형성시킨다. 또한, AP-1c-Jun, c-Fosheterodimer 또는 c-Jun, c-Junhomodimer로 생성될 수 있다. c-JunJNK에 의해 인산화되어 그 활성을 나타나게 되며, c-FosERK에 의해 인산화되어 활성을 나타낸다. 따라서, c-jun 인산화 정도를 측정하는 것은 자외선에 의한 피부손상 정도를 간접적으로 확인할 수 있는 바이오마커로 활용할 수 있다.
실험재료
필요장비 및 소모품
Inverted microscope, 세포 배양기, 원심분리기, SDS-PAGE-전기영동장치, OHP film, Cassette, PVDF membrane, Agfa medical X-ray film
 
필요시약
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM), Fetal bovine serum(FBS), Penicillin/streptomycin, 0.5% Trypsin-EDTA, Phosphate buffer saline (PBS), DC Protein Assay, PROTEIN-PAGE-10%, PROTEIN-PAGE-5% stacking gel, 5X SDS loading buffer, 10X Tris-Glycine Buffer, 4X Transfer Buffer, Cell lysis buffer (10X), ECL + reagent, Skim milk, Tris Buffer with Tween 20(TBST), c-Jun antibody, phospho c-Jun antibody, Anti-rabbit IgG-HRP, VIVID DEVELOPER, VIVID FIXER, Methyl alcohol 
세포주
Human keratinocyte cell line
 
실험방법
1. 세포를 적정한 수로 dish 에 배지와 함께 넣어 배양한다.
2. 세포가 dish 에 가득 차면 serum-free 배지로 24시간 starvation 한다.
3. Sample 을 포함한 배지로 바꿔서 sample 을 처리한 후 3시간 동안 배양한다.
4. Cell lysis 후 단백질 양을 정량하여 SDS sample buffer 에 동량을 섞어준다.
5. 5분간 heat boiling 해준 후 얼음에서 냉각해준다.
6. 10 % SDS-polyacrylamide gel loading PVDF membrane 으로 transfer 한다.
7. Membrane 5% skim milk solution 1시간 blocking 을 해준 후 5% skim milk 에 희석된 c-Jun, p-c-Jun antibody4overnight 해준다.
8. TBST solution30분간 shaking washing 을 해준 후 2antibody 를 붙여준다.
9. 암실에서 ECL plus solution 을 이용하여 반응을 시켜주며 western blot film에 결과를 도출해낸다.
결과해석
자외선에 의해 유도된 c-Jun/p-c-Jun 단백질 발현을 확인하는 실험으로, band intensity를 통해 발현량을 확인할 수 있다. 피부건강 소재에 의해 자외선을 조사한 세포에서 c-Jun/p-c-Jun 단백질 발현이 감소되면 자외선에 의한 피부손상이 억제할 것으로 판단할 수 있다. 
참고문헌 1. Feng M. Ho, Shing H. Liu, Chiau S. Liau, Por J. Huang and Shoei Y. Lin-Shiau, High Glucose–Induced Apoptosis in Human Endothelial Cells Is Mediated by Sequential Activations of c-Jun NH2-Terminal Kinase and Caspase-3, American Heart Association, 101(22) p2618-2624, 2000
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제목 인간 표피 각화세포에서 c-Jun/p-c-Jun 단백질 발현 측정 링크 자외선에 의한 피부보호
실험재료
필요장비 및 소모품
Inverted microscope (범용), 배양기 (범용), 원심분리기 (범용), Cell culture dish (Falcon), PCR machine (범용), Nanodrop (범용), 전기영동장치, transfer 장치, power supply
 
필요시약
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) (Thermo), Fetal bovine serum (FBS) (Thermo), Penicillin/streptomycin (Welgene), Trypsin 0.25%-EDTA (Biowest), Phosphate buffer saline (PBS) (바이오세상), DC Protein Assay (Biorad), PROTEIN-PAGE-10%, PROTEIN-PAGE-5% stacking gel, 6X SDS loading buffer, 10X Tris-Glycine Buffer, 5X Transfer Buffer, Cell lysis buffer (10X) (Cell signaling), ECL reagent (ATTA), Skim milk (Difco), Tris Buffer with Tween 20(TBST), c-Jun antibody, phospho c-Jun rabbit polyclonal antibody(Cell signaling), Anti-rabbit IgG-HRP(Cell signaling), VIVID DEVELOPER, VIVID FIXER, Methyl alcohol
 
실험방법
1. 배지 조성
배양용 배지 : DMEM 배지 450 mLFBS 50 ml, Antibiotic(Strep./Peni.) 1 ml을 각 농도에 맞게 첨가해준 후 잘 흔들어준 후 24시간 정치 후 사용한다.
Serum-free 배지 : DMEM 배지에 FBS 0.5 ml, Antibiotic(Strep./Peni.) 1 ml을 각 농도에 맞게 첨가해준 후 잘 흔들고 24시간 정치 후 사용한다.
 
2. 세포 배양, 시료 처리, 세포 harvest
* 실험 시작 전 필요한 배지, PBS37항온수조기에 미리 데워둔다.
1) 무균작업대에서 6 cm 배양 접시에 세포가 1 x 10되도록 seeding 한 후 48시간 배양한다.
2) 세포가 70-80% 정도 되면 serum starvation24시간 한다.
3) 시료를 일정 농도로 처리하고 1시간 동안 배양한다.
4) 1시간 후 UVB(0.05 J/cm2)를 조사하고 30분 동안 배양한다.
5) 배지를 suction 한 후 cold PBS 3 mL2washing 해 준다.
6) 남아 있는 PBS를 완전히 제거한 후 cell lysis buffer 80 μL를 넣는다.
7) 얼음 위에서 scraper를 이용하여 6 cm 배양 접시의 세포를 긁어모아 1.5 mL e-tube에 담아 얼음에서 10 분에 한번 씩 vortexing 하면서 30분 동안 배양한다.
8) 30분 후 centrifugation(14000 rpm, 4, 15 min) 하고 상층액을 새 1.5 mL e-tube로 옮긴다.
 
3. Loading, Blotting
1) 농축된 배지의 단백질 양을 DC protein assay kit을 이용하여 정량하여 SDS sample buffer에 동량을 섞어준다.
2) 5분간 95℃에서 Heat boiling해준 후 얼음에서 냉각해준다.
3) 10% SDS-polyacrylamide gel에 Loading 하고 90V 20분, 110V로 90분 전기영동한다.
Tips:
- 10 % SDS-polyacrylamide gel 만드는 법
PROTEIN-PAGE-10% 용액 : APS : TEMED = 8 mL : 40 uL : 8 uL의 비율로 50 mL tube에 담아 잘 섞은 후 casting에 넣는다. Gel 넣고 70% 에탄올을 채워준다. Gel이 굳으면 70% 에탄올을 버리고 comb을 꽂는다. 5% stacking gel (PROTEIN-PAGE-5% stacking gel 용액 APS : TEMED = 4 mL : 50 uL : 4 uL)을 1000 uL pipette을 사용하여 comb 사이로 넣어주어 gel을 굳힌다.
4) 전기영동이 끝나면 젤을 메탄올에 activation 시킨 PVDF membrane으로 transfer한다.
Tips:
- Transfer 방법
<스폰지-3M paper-PVDF membrane-gel-3M paper-스폰지>의 형태로 샌드위치 모양을 만든 후, Transfer buffer를 충분히 적신 후 90~110 mA로 100~120분 transfer 한다.
① PVDF Membrane을 메탄올에 담궈 activation 시킨 후 5% skim milk (Skim milk 25 g + 500 ml TBST)에 2시간 blocking 을 해준다.
② AQP3 antibody를 5% skim milk-TBST solution에 1:1000 배수로 희석한 용액에 PVDF membrane를 담가 4℃에서 overnight으로 gently shaking한다.
③ TBST solution으로 10분씩 세 번 washing을 해준다.
④ 2차 anti goat antibody를 5% skim milk에 1:5000 배수로 희석한 후, 상온에서 1시간 동안 붙여준다.
⑤ 2차 antibody를 붙인 후 TBST solution으로 10분씩 세 번 washing 해준다.
5) Film 현상
Developer, Fixer, 카세트, membrane 당 2개의 OHP film, ECL plus, pipetter, 물통을 준비한다.
① 암실에서 문을 잠그고 불 켠 채로 카세트를 꺼낸다.
② 카세트 안을 깨끗이 닦은 후 OHP film을 깐다.
③ 불을 끄고 developer와 fixer를 각각의 통에 넣는다.
④ E-tube에 ECL + A 500 ul와 B 12.5 ul를 섞는다.
⑤ 폐액통에 TBST 용액을 완전히 털어 버린 후 e-tube에 섞어 놓은 reagent를 membrane에 골고루 뿌려준다.
⑥ 핀셋으로 끝에 잡아 OHP film위에 올리고 다른 OHP film으로 덮고 핸드타올로 기포를 제거한다.
⑦ 그 위에 AGFA film을 올리고 카세트를 닫는다.
⑧ 카세트를 열어 AGFA film을 꺼내 developer 통에 담궈 현상하고 fixer에 담근다.
⑨ 불을 켜기 전에 developer, AGFA film, ECL + 용액을 정리 한다.
⑩ 나온 film들을 가지고 간 물통에 옮겨 담아서 나온다.
실험결과 예

결과해석
밴드의 intensity 정도 차이를 통해 c-Jun, p-c-Jun의 인산화정도를 분석할 수 있다. 자외선에 의해 c-Jun의 인산화는 증가하였으며, 시험물질에 의해 농도 의존적으로 억제됨을 알 수 있다.
참고문헌
첨부파일
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