1. 배지 제조
배양용 배지 : Keratinocyte culture medium(Cascade Biologics, Portland, OR, USA), Bovine pituitary extract (0.2%, v/v), insulin (5 ug/mL), hydrocortisone (0.18 μg/mL), bovine transferrin (5 μg/mL), human epidermal growth factor (0.2 ng/mL), 0.07 mM calsium chloride
 
2. 세포배양
세포가 80-90% 밀도가 되면 성장단계 또는 분화된 상태의 각화세포로 실험을 하기 위해서 각각의 배지를 사용한다.
1) 초기분화 각화세포(early-differentiation keratinocytes)는 1.2 mM calsium 가 첨가된 각화세포 성장배지로 3일 동안배양 하여 얻는다.
2) 말기분화 각화세포(late differentiation keratinocytes)는 DMEM과 Ham’s F-12 (2:1, v/v) 배지(1.2 mM calcium, 10% fetal bovine serum, 10 μg/mL insulin, 0.4 μg/mL hydrocortisone, 50 μg/mL vitamin C).
일주일에 3번 배지를 교환하고 11동안 배양 후 세포를 얻는다.
 
3. 실험방법
1) 세포의 밀도가 80-90%가 되면 차가운 PBS로 2번 세척한다.
2) PBS가 존재하는 상태에서 scrapper로 세포를 harvest한다.
3) 1.5 mL 튜브로 옮기고 5분 동안 원심분리(240×g) 한다.
4) Sphinogid base와 sphingoid base 1-phosphages를 얻기위해 원심분리 후 상층액을 제거하고 펠렛에 500 μL의 PBS를 가하고 ultrasonicater로 10초동안 균질화 한다.
Tips: 원심분리 후 상층액은 DNA 또는 단백질을 분석하는데 사용한다.
5) MeOH 350 μL , 1M NaCl 150 μL, CHCl3 300 μL을 펠렛에 가한다.
6) 3N NaOH 35 μg을 가하여 pH를 10-11로 맞추고 sphingoid base와 sphingoid base 1-phosphate를 하층과 상층으로 분리한다.
7) 내부 표준물질로 자연적으로 합성되지 않는 C17 SO (100 pmol)과 C17 SIP (100 pmol)을 넣고 1시간 동안 강하게 교반한다.
8) 3분 동안 원심분리(240×g) 후 하층은 증발기를 통해 증발시키고 0.15 M metanolic KOH 500 μg을 가하고 37℃ 20분 교반하여 용해한다.
9) 다시 CHCl3 500 μg, 2N NH40H 100 μg, alkaline water 400 μg을 가하고 1시간동안 교반하고 3분동안 원심분리 한다.
10) Speed Vac 농축기로 CHCl3를 제거한다
11) 지질추출물에 MeOH 120 μL를 가하여 재 용해시킨 다음, OPA 대사체 20 μL, O-phthaldialdehyde 50 mg, EtOH 1 mL, 2-mercaptoehtanol 100 μL, 3% (w/v) boric acid 50 mL을 가하고 상온에서 30분 동안 배양한다.
12) Ceramide 유도체(spingoid base)는 HPLC(Jasco PU-980 pump, Jasco AS-1559 autosampler, Jasco FP-920 fluorescence detector(Tokyo, Japan)
로 분석한다.
- 이동상 조건: 0.1% trietylamine이 함유된 92% methanol
- 이동상 속도: 1 mL/min
13) 70 μL의 시료를 injection하고 C18 컬럼(Waters, Sunfire 4.6×150 mm ID)로 분리하였다.
14) Sphingoid 유도체 C17 SO(8.5 min), C18  SO(10.5 min), C18 SA(14.2 min)의 형광은 emission 455 nm과 excitation 340 nm 조건에서 각각 측정하였다.
15) DNA 함량을 측정한다.
① 4)의 펠렛에 0.1 μg/mL bisbenzimide를 포함하는 1X 형광분석 버퍼(100 mM Tris-HCl[pH 7.4], 10 mM EDTA, 2M NaCl) 200 μL를 혼합하고 바로 360 nm(excitation)과 460 nm(emission)에서의 흡광도를 측정한다.
② 대조구는 calf thymus DNA(Sigma-Aldrich) 0.1-10 μg/mL 농도를 사용하였다.