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피부건강

시험관내 및 세포실험법

제목 인간표피 각화세포에서 sphingoid 함량 측정
구분 피부건강 링크 자외선에 의한 피부보호
실험배경
피부 자체가 함유하는 수분량은 피부결을 좌우하는 가장 중요한 요소이다. 즉 피부 자체의 수분이 충분하면 피부결이 매끄럽지만 부족하면 피부의 감촉은 거칠어진다. 건강한 표피의 각질층은 15-20%의 수분을 함유하고 있으며 수분이 10% 이하로 떨어지면 피부가 건조해지고 윤기와 탄력이 없어져 주름이 증가하게 된다.

[그림. 피부조직]
피부의 제일 바깥 층을 이루는 stratum cornenum(SC)은 수분의 손실을 막는 역할을 하며, 비극성 지질과 각화된 세포의 혼합체로 존재한다. 일반적으로 피부표면의 수분 정도는 15%(wt/wt)이며 SCstratum granulosum interface의 경우에는 30%(wt/wt) 이다. 피부의 탄력성이나 부드럽고 촉촉한 느낌은 피부의 가장 외층인 표피의 각질층에 존재하는 수분에 의해 유지된다. 각질층의 수분 함량은 표피에서 생성 분비되는 지질 혼합체인 피지막과 SC 내에 존재하는 수용성 성분인 자연 보습인자 (NMF: Natural Moisturing Factor)에 의해 결정된다. 피부의 수분 증발은 표피의 세라마이드를 포함한 지질의 함량과 NMF의 함량 변화와 밀접한 관계가 있다. 이와 같이, 피부의 보습을 유지하는데 중요한 역할을 하는 세라마이드는 sphingolipids 대사과정에서 spingosine, sphinganin과 같은 sphingoid base와 긴 유리 지방산의 축합에 의해 생성되기 때문에 sphingosine 함량 증가는 세라마이드 증가, 결국 피부보습을 간접적으로 예측할 수 있다.
실험재료
필요장비 및 소모품
도립현미경, 분광광도계, 무균작업대, 항온수조, 원심분리기, HPLC, C18 column, Speed Vac concentrator, 세포배양용 플레이트(T75), 세포배양기, 1회용 pipette, pipette, pipette tip, cell counter
 
필요시약
Deratinocyte culture medium, Bovine pituitary extract (0.2%, v/v), insulin (5 ug/mL), hydrocortisone (0.18 μg/mL), bovine transferrin (5 μg/mL), human epidermal growth factor (0.2 ng/mL), 0.07 mM calsium chloride, Penicillin/streptomycin, Trypsin 0.25%-EDTA, Phosphate buffer saline (PBS), MeOH, NaCl, CHCl3, C17 SO, C17 SIP, OPA derivatization
 
세포주
Human epidermal keratinocyte
 
실험방법
1. 세포의 밀도가 80-90%가 되면 차가운 PBS2번 세척하고 세포를 harvest 한다.
2. 5분 동안 원심분리(240×g) 후 상층액을 제거하고 펠렛에 500 μLPBS를 가하고 ultrasonicater10초동안 균질화 한다.
3. MeOH 350 μL , 1M NaCl 150 μL, CHCl3 300 μL을 펠렛에 가한다.
4. 3N NaOH 35 μg을 가하여 pH10-11로 맞추고 sphingoid basesphingoid base 1-phosphate를 하층과 상층으로 분리한다.
5. 내부 표준물질로 자연적으로 합성되지 않는 C17 SO (100 pmol)C17 SIP (100 pmol)을 넣고 1시간 동안 강하게 교반한다.
6. 3분 동안 원심분리(240×g) 후 하층은 증발기를 통해 증발시키고 0.15 M metanolic KOH 500 μg을 가하고 3720분 교반하여 용해한다.
7. 다시 CHCl3 500 μg, 2N NH40H 100 μg, alkaline water 400 μg을 가하고 1시간동안 교반하고 3분 동안 원심분리 한다.
8. CHCl3를 증발제거하고, 지질추출물에 MeOH 120 μL를 가하여 재 용해시킨 다음, OPA 대사체 20 μL, O-phthaldialdehyde 50 mg, EtOH 1 mL, 2-mercaptoehtanol 100 μL, 3% (w/v) boric acid 50 mL을 가하고 상온에서 30분 동안 배양한다.
9. Ceramide 유도체(spingoid base)HPLC(Jasco PU-980 pump, Jasco AS-1559 autosampler, Jasco FP-920 fluorescence detector(Tokyo, Japan))를 통해 emission 455 nmexcitation 340 nm 조건에서 각각 측정한다.
결과해석
Sphingoid 함량이 높으면, 피부보습에 영향을 미칠 것으로 판단할 수 있다.
참고문헌 1. Scharffetter-Kochanek K, Brenneisen P, Wenk J, Herrmann G, Ma W, Kuhr L, Meewes C, Wlaschek, Photoaging of the skin from phenotype to mechanisms, Exp Gerontol, 35(3) p307-316, 2000
2. Kim J, Yun H, Cho Y, Analysis of ceramide metabolites in differentiating epidermal keratinocytes treated with calcium or vitamin C, Nutr Res Pract, 5(5) p396-403, 2011
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제목 인간표피 각화세포에서 sphingoid 함량 측정 링크 자외선에 의한 피부보호
실험재료
필요장비 및 소모품
도립현미경(Olympus), 분광광도계(Jasco), 무균작업대(수공테크), 항온수조(대일화학), 원심분리기(Sorvall fresco), HPLC(Jasco, Tyoko, Japan), C18 column(Waters, Sunfire 4.6×150 nm ID), Speed Vac concentrator(Hanil, Seoul, Korea), 세포배양용 플레이트(T75, SPL), 세포배양기(Thermo scientific), 1회용 pipette(10 ml, BD falcon), pipette(Thermo scientific), pipette tip(QSP), cell counter(Invitrogen)
 
필요시약
Deratinocyte culture medium(Cascade Biologics, Portland, OR, USA), Bovine pituitary extract (0.2%, v/v), insulin (5 ug/mL), hydrocortisone (0.18 μg/mL), bovine transferrin (5 μg/mL), human epidermal growth factor (0.2 ng/mL), 0.07 mM calsium chloride(Cascade Biologics, Portland, OR, USA), Penicillin/streptomycin (Welgene), Trypsin 0.25%-EDTA (Biowest), Phosphate buffer saline (PBS) (바이오세상), MeOH(Sigma-Aldrich), NaCl(Sigma-Aldrich), CHCl3(Sigma-Aldrich), C17 SO(Sigma-Aldrich), C17 SIP(Sigma-Aldrich), OPA derivatization(Sigma-Aldrich)
 
실험방법
1. 배지 제조
배양용 배지 : Keratinocyte culture medium(Cascade Biologics, Portland, OR, USA), Bovine pituitary extract (0.2%, v/v), insulin (5 ug/mL), hydrocortisone (0.18 μg/mL), bovine transferrin (5 μg/mL), human epidermal growth factor (0.2 ng/mL), 0.07 mM calsium chloride
 
2. 세포배양
세포가 80-90% 밀도가 되면 성장단계 또는 분화된 상태의 각화세포로 실험을 하기 위해서 각각의 배지를 사용한다.
1) 초기분화 각화세포(early-differentiation keratinocytes)는 1.2 mM calsium 가 첨가된 각화세포 성장배지로 3일 동안배양 하여 얻는다.
2) 말기분화 각화세포(late differentiation keratinocytes)는 DMEM과 Ham’s F-12 (2:1, v/v) 배지(1.2 mM calcium, 10% fetal bovine serum, 10 μg/mL insulin, 0.4 μg/mL hydrocortisone, 50 μg/mL vitamin C).
일주일에 3번 배지를 교환하고 11동안 배양 후 세포를 얻는다.
 
3. 실험방법
1) 세포의 밀도가 80-90%가 되면 차가운 PBS로 2번 세척한다.
2) PBS가 존재하는 상태에서 scrapper로 세포를 harvest한다.
3) 1.5 mL 튜브로 옮기고 5분 동안 원심분리(240×g) 한다.
4) Sphinogid base와 sphingoid base 1-phosphages를 얻기위해 원심분리 후 상층액을 제거하고 펠렛에 500 μL의 PBS를 가하고 ultrasonicater로 10초동안 균질화 한다.
Tips: 원심분리 후 상층액은 DNA 또는 단백질을 분석하는데 사용한다.
5) MeOH 350 μL , 1M NaCl 150 μL, CHCl3 300 μL을 펠렛에 가한다.
6) 3N NaOH 35 μg을 가하여 pH를 10-11로 맞추고 sphingoid base와 sphingoid base 1-phosphate를 하층과 상층으로 분리한다.
7) 내부 표준물질로 자연적으로 합성되지 않는 C17 SO (100 pmol)과 C17 SIP (100 pmol)을 넣고 1시간 동안 강하게 교반한다.
8) 3분 동안 원심분리(240×g) 후 하층은 증발기를 통해 증발시키고 0.15 M metanolic KOH 500 μg을 가하고 37℃ 20분 교반하여 용해한다.
9) 다시 CHCl3 500 μg, 2N NH40H 100 μg, alkaline water 400 μg을 가하고 1시간동안 교반하고 3분동안 원심분리 한다.
10) Speed Vac 농축기로 CHCl3를 제거한다
11) 지질추출물에 MeOH 120 μL를 가하여 재 용해시킨 다음, OPA 대사체 20 μL, O-phthaldialdehyde 50 mg, EtOH 1 mL, 2-mercaptoehtanol 100 μL, 3% (w/v) boric acid 50 mL을 가하고 상온에서 30분 동안 배양한다.
12) Ceramide 유도체(spingoid base)는 HPLC(Jasco PU-980 pump, Jasco AS-1559 autosampler, Jasco FP-920 fluorescence detector(Tokyo, Japan)
로 분석한다.
- 이동상 조건: 0.1% trietylamine이 함유된 92% methanol
- 이동상 속도: 1 mL/min
13) 70 μL의 시료를 injection하고 C18 컬럼(Waters, Sunfire 4.6×150 mm ID)로 분리하였다.
14) Sphingoid 유도체 C17 SO(8.5 min), C18  SO(10.5 min), C18 SA(14.2 min)의 형광은 emission 455 nm과 excitation 340 nm 조건에서 각각 측정하였다.
15) DNA 함량을 측정한다.
① 4)의 펠렛에 0.1 μg/mL bisbenzimide를 포함하는 1X 형광분석 버퍼(100 mM Tris-HCl[pH 7.4], 10 mM EDTA, 2M NaCl) 200 μL를 혼합하고 바로 360 nm(excitation)과 460 nm(emission)에서의 흡광도를 측정한다.
② 대조구는 calf thymus DNA(Sigma-Aldrich) 0.1-10 μg/mL 농도를 사용하였다.
실험결과 예

출처 : Kim J et al., 2011
결과해석
비타민 C를 처리한 keratinocyte(late diff)에서 sphingosine 함량이 유의적으로 증가하였다.
참고문헌 1. Kim J, Yun H, Cho Y, Analysis of ceramide metabolites in differentiating epidermal keratinocytes treated with calcium or vitamin C, Nutr Res Pract, 5(5) p396-403, 2011
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