국민의 더 안전하고 건강한 삶을 위한
건강기능식품 플랫폼

  • 통합검색
  • 인정현황
  • 내게맞는실험법
  • 기능지표성분분석법
  • top

피부건강

시험관내 및 세포실험법

제목 B16 쥐 흑색종 세포에서 tyrosinase 활성 측정
구분 피부건강 링크 자외선에 의한 피부보호
실험배경

 
멜라닌의 합성은 세포막에 결합되어 있으며 구리를 함유하는 당단백질인 tyrosinase에 의해 활성화된다. Tyrosinasemelanocyte에서만 생성되며 endoplasmic reticulum에서 생성되어 Golgi에서 그 기능과 3차 구조를 갖게 되며 melanocyte 주변에 있는 keratinocyte로 이동되어 색깔을 나타내게 된다. 과한 멜라닌의 생성 또는 비정상적인 분포는 피부의 이상색소침착을 발생시킨다. 실험을 통해 세포내 존재하는 tyrosinase를 분리하고 이 기질이 되는 L-DOPA를 첨가하여 DOPAchrome의 생성을 흡광도의 변화를 통해 그 활성을 측정한다.
실험재료
필요장비 및 소모품
도립현미경(Inverted microscope), 무균작업대(Clean bench), 항온수조(Water bath), 세포 배양기(CO2 incubator), 원심분리기(Centrifuge), 세포배양 플라스크(T25/T75), 1회용 pipette(10 ml), pipet aid, cell counter
 
필요시약
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Fetal Bovine Serum (FBS), 0.5% trypsin-EDTA, Penicillin/streptomycin, Phosphate buffer saline (PBS), α-MSH(Simga)
 
세포주
B16-F10 murine melanoma
 
실험방법
1. B16/F10 흑색종 세포주를 6 well plate5×104/mL이 되게 준비한다.
2. 24시간 후 α-MSH과 시료를 동시에 처리하고 다시 36시간에 배지를 교환하면서 시료, α-MSH를 다시 가하고 72시간 까지 배양한다.
3. Trypsin-EDTA 300 uL를 가하여 세포를 수확한 후 인산나트륨 버퍼를 가하고 초음파 분쇄한다.
4. 얼음에 1시간동안 반응시킨 후 20분간 원심분리 한다.
5. 원심분리 후 상층액 100 uL33 mM 인산나트륨용액(pH 6.9), 9 M L-tyrosine4 mM L-DOPA를 혼합액을 가하고 37항온기에서 2시간 반응시킨다.
6. 반응물의 흡광도를 475 nm에서 측정한다.
결과해석
시험물질에 의한 tyrosinase 활성 감소는 melanin 합성에 영향을 미칠 것으로 판단되며, 결과적으로 피부색소 침착 감소를 예측할 수 있다.
참고문헌 1. Wu Li, Lin Y, Antimelanogenic effect of c-phycocyanin through modulation of tyrosinase expression by upregulation of ERK and downregulation of p38 MAPK signaling pathways, J Biomed Sci, 18() p74, 2011
목록보기
제목 B16 쥐 흑색종 세포에서 tyrosinase 활성 측정 링크 자외선에 의한 피부보호
실험재료
필요장비 및 소모품
도립현미경(Olympus), 분광광도계(Jasco), 무균작업대(수공테크), 항온수조(대일화학), 원심분리기(Sorvall fresco), Microplate reader(Bio-rad), 세포배양용 플레이트(T75, SPL), 6 Well plate (SPL), 세포배양기(Thermo scientific), 1회용 pipette(10 ml, BD falcon), pipette(Thermo scientific), pipette tip(QSP), cell counter(Invitrogen), 초음파기
 
필요시약
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) (Thermo), Fetal bovine serum (FBS) (Thermo), Penicillin/streptomycin (Welgene), Trypsin 0.25%-EDTA (Biowest), Phosphate buffer saline (PBS) (바이오세상), phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF), Triton X-100, Disodium phosphate
 
실험방법
1. 배지 제조
배양용 배지 : DMEM배지 500 mlFBS 50 ml, Antibiotic(Strep./Peni.) 1 ml을 각 농도에 맞게 첨가해준 후 잘 흔들어준 후 사용한다.
 
2. 실험방법
1) B16/F10 흑색종 세포주를 6 well plate5×104/mL이 되게 준비한다.
2) 24시간 후 α-MSH 50 nM과 시료를 동시에 처리한다.
3) 배양 36시간 후 배지를 교환한다. 이때, α-MSH 50 nM과 시료를 다시 처리하고 72시간까지 배양한다.
4) Trypsin-EDTA 300 uL를 가하여 세포를 수확한다.
5) 0.2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF)1% Triton X-100을 함유한 67 mM 인산나트륨 완충용액(pH 6.8)500 μL 처리하고 초음파로 분쇄한다.
6) 얼음에 1시간동안 반응시킨 후 4원심분리기에서 15,000 rpm으로 20분간 원심분리 한다.
7) 원심분리 후 상층액 100 uL33 mM 인산나트륨용액(pH 6.9), 9 M L-tyrosine4 mM L-DOPA를 혼합액을 가하고 37항온기에서 2시간 반응시킨다.
8) 반응물의 흡광도를 475 nm에서 측정한다.
실험결과 예
결과해석
반응중에 생성된 DOPAchrome475 nm에서 측정하여 멜라닌 생성을 유도한 대조구(α-MSH 처리구)를 기준으로 하여 상대적인 활성을 나타낸다. 각각의 데이터는 단백질의 양으로 보정하여 나타낸다. 결과를 살펴보면, 시험물질이 tyrosinase 활성을 농도 의존적으로 억제하였다.
참고문헌 1. Wu LC, Lin YY, Yang SY, Weng YT, Tasi YT, Antimelanogenic effect of c-phycocyanin through modulation of tyrosinase expression by upregulation of ERK and downregulation of p38 MAPK signaling pathways, J Biomed Sci, 18(1) p74, 2011
첨부파일
목록보기