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피부건강

시험관내 및 세포실험법

제목 B16 쥐 흑색종 세포에서 TRP-1/2 단백질 발현 측정
구분 피부건강 링크 자외선에 의한 피부보호
실험배경
(Ling Hou et al. 2008)
[그림] Trp-1의 합성도
Tyrosinase-related protein-1(Trp-1)은 멜라노사이트에 특이적인 유전자로 멜라닌 합성에 관여한다. Trp-1은 tyrosinase 단백질의 안정화와 촉매적 활성을 조절한다. 또한, Trp-1은 멜라노좀 구조 유지에 관여하며, 멜라노사이트의 성장에 영향을 미친다. 멜라노사이트에서 Ras/MEK/ERK 또는 PKC/ERK의 신호전달 네트워크에 의해 활성화된 전사인자 MITF는 tyrosinase를 전사하게 되며, tryrosinase 안정화에 기여하는 Trp-1의 mRNA의 발현도 증가하게 된다. 따라서, Trp-1 단백질 발현을 측정함으로써 tyrosinase의 단백질발현과 melanin 합성을 간접적으로 분석가능하다.
실험재료
필요장비 및 소모품
Inverted microscope, 세포 배양기, 원심분리기, SDS-PAGE-전기영동장치, OHP film, Cassette, PVDF membrane, Agfa medical X-ray film
 
필요시약
RPMI-1640 medium, Fetal bovine serum(FBS), Penicillin/streptomycin, 0.5% Trypsin-EDTA, Phosphate buffer saline (PBS), DC Protein Assay, PROTEIN-PAGE-10%, PROTEIN-PAGE-5% stacking gel, 5X SDS loading buffer, 10X Tris-Glycine Buffer, 4X Transfer Buffer, Cell lysis buffer (10X), ECL + reagent, Skim milk, Tris Buffer with Tween 20(TBST), TRP-1/2 antibody, Anti-rabbit IgG-HRP, VIVID DEVELOPER, VIVID FIXER, Methyl alcohol 
세포주
B16 mouse melanoma cells
 
실험방법
1. 세포를 적정한 수로 dish 에 배지와 함께 넣어 배양한다.
2. 세포가 dish 에 가득 차면 serum-free 배지로 24시간 starvation 한다.
3. Sample 을 포함한 배지로 바꿔서 sample 을 처리한 후 3시간 동안 배양한다.
4. Cell lysis 후 단백질 양을 정량하여 SDS sample buffer 에 동량을 섞어준다.
5. 5분간 heat boiling 해준 후 얼음에서 냉각해준다.
6. 10 % SDS-polyacrylamide gel 에 loading 후 PVDF membrane 으로 transfer 한다.
7. Membrane 을 5% skim milk solution 에 2시간 blocking 을 해준 후 5% skim milk 에 희석된 TRP-1/2 antibody에 4℃ overnight 해준다.
8. TBST solution에 30분간 shaking washing 을 해준 후 2차 antibody 를 붙여준다.
9. 암실에서 ECL plus solution 을 이용하여 반응을 시켜주며 western blot film에 결과를 도출해낸다.
결과해석
시험물질에 의한 TRP-1/2 단백질 발현 감소는 tyrosinase 및 melanin 합성에 영향을 미칠 것으로 판단되며, 결과적으로 피부색소 침착 감소를 예측할 수 있다.
 
참고문헌 1. Hou L, Pavan WJ., Transcriptional and signaling regulation in neural crest stem cell-derived melanocyte development: do all roads lead to Mitf?, Cell Res, 18(12) p1163-1176, 2008
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제목 B16 쥐 흑색종 세포에서 TRP-1/2 단백질 발현 측정 링크 자외선에 의한 피부보호
실험재료
필요장비 및 소모품
Inverted microscope (범용), 배양기 (범용), 원심분리기 (범용), Cell culture dish (Falcon), PCR machine (범용), Nanodrop (범용), 전기영동장치, transfer 장치, power supply
 
필요시약
RPMI-1640 medium, Fetal bovine serum (FBS), Penicillin/streptomycin, Trypsin 0.25%-EDTA, Phosphate buffer saline (PBS), DC Protein Assay, PROTEIN-PAGE-10%, PROTEIN-PAGE-5% stacking gel, 6X SDS loading buffer, 10X Tris-Glycine Buffer, 5X Transfer Buffer, Cell lysis buffer (10X) (Cell signaling), ECL reagent, Skim milk, Tris Buffer with Tween 20(TBST), TRP-1/2 rabbit polyclonal antibody(Cell signaling), Anti-rabbit IgG-HRP(Cell signaling), VIVID DEVELOPER, VIVID FIXER, Methyl alcohol 
실험방법
1. 배지 조성
배양용 배지 : DMEM 배지 450 mL에 FBS 50 ml, Antibiotic(Strep./Peni.) 1 ml을 각 농도에 맞게 첨가하여 잘 흔들어준 후 사용한다.
Serum-free 배지 : DMEM 배지에 FBS 0.5 ml, Antibiotic(Strep./Peni.) 1 ml을 각 농도에 맞게 첨가하여 잘 흔들어준 후 사용한다.
 
2. 세포 배양, 시료 처리, 세포 harvest
실험 시작 전 필요한 배지, PBS를 37℃ 항온수조기에 미리 데워둔다.
1) 무균작업대에서 6 cm 배양 접시에 세포가 1 x 10⁵ 되도록 seeding 한 후 48시간 배양한다.
2) 세포가 70-80% 정도 되면 serum starvation을 24시간 한다.
3) 시료를 일정 농도로 처리하고 1시간 동안 배양한다.
4) 1시간 후 UVB(0.05 J/cm2)를 조사하고 30분 동안 배양한다.
5) 배지를 suction 한 후 cold PBS 3 mL로 2번 washing 해 준다.
6) 남아 있는 PBS를 완전히 제거한 후 cell lysis buffer 80 μL를 넣는다.
7) 얼음 위에서 scraper를 이용하여 6 cm 배양 접시의 세포를 긁어모아 1.5 mL e-tube에 담아 얼음에서 10 분에 한번 씩 vortexing 하면서 30분 동안 배양한다.
8) 30분 후 centrifugation(14000 rpm, 4℃, 15 min) 하고 상층액을 새 1.5 mL e-tube로 옮긴다.
 
3. Loading, Blotting
1) 농축된 배지의 단백질 양을 DC protein assay kit을 이용하여 정량하여 SDS sample buffer에 동량을 섞어준다.
2) 5분간 95℃에서 Heat boiling해준 후 얼음에서 냉각해준다.
3) 10% SDS-polyacrylamide gel에 Loading 하고 90V 20분, 110V로 90분 전기영동한다.
Tips:
- 10 % SDS-polyacrylamide gel 만드는 법
PROTEIN-PAGE-10% 용액 : APS : TEMED = 8 mL : 40 uL : 8 uL의 비율로 50 mL tube에 담아 잘 섞은 후 casting에 넣는다. Gel 넣고 70% 에탄올을 채워준다. Gel이 굳으면 70% 에탄올을 버리고 comb을 꽂는다. 5% stacking gel (PROTEIN-PAGE-5% stacking gel 용액 APS : TEMED = 4 mL : 50 uL : 4 uL)을 1000 uL pipette을 사용하여 comb 사이로 넣어주어 gel을 굳힌다.
4) 전기영동이 끝나면 젤을 메탄올에 activation 시킨 PVDF membrane으로 transfer한다.
Tips:
- Transfer 방법
<스폰지-3M paper-PVDF membrane-gel-3M paper-스폰지>의 형태로 샌드위치 모양을 만든 후, Transfer buffer를 충분히 적신 후 90~110 mA로 100~120분 transfer 한다.
① PVDF Membrane을 메탄올에 담궈 activation 시킨 후 5% skim milk (Skim milk 25 g + 500 ml TBST)에 2시간 blocking 을 해준다.
② AQP3 antibody를 5% skim milk-TBST solution에 1:1000 배수로 희석한 용액에 PVDF membrane를 담가 4℃에서 overnight으로 gently shaking한다.
③ TBST solution으로 10분씩 세 번 washing을 해준다.
④ 2차 anti goat antibody를 5% skim milk에 1:5000 배수로 희석한 후, 상온에서 1시간 동안 붙여준다.
⑤ 2차 antibody를 붙인 후 TBST solution으로 10분씩 세 번 washing 해준다.
5) Film 현상
Developer, Fixer, 카세트, membrane 당 2개의 OHP film, ECL plus, pipetter, 물통을 준비한다.
① 암실에서 문을 잠그고 불 켠 채로 카세트를 꺼낸다.
② 카세트 안을 깨끗이 닦은 후 OHP film을 깐다.
③ 불을 끄고 developer와 fixer를 각각의 통에 넣는다.
④ E-tube에 ECL + A 500 ul와 B 12.5 ul를 섞는다.
⑤ 폐액통에 TBST 용액을 완전히 털어 버린 후 e-tube에 섞어 놓은 reagent를 membrane에 골고루 뿌려준다.
⑥ 핀셋으로 끝에 잡아 OHP film위에 올리고 다른 OHP film으로 덮고 핸드타올로 기포를 제거한다.
⑦ 그 위에 AGFA film을 올리고 카세트를 닫는다.
⑧ 카세트를 열어 AGFA film을 꺼내 developer 통에 담궈 현상하고 fixer에 담근다.
⑨ 불을 켜기 전에 developer, AGFA film, ECL + 용액을 정리 한다.
⑩ 나온 film들을 가지고 간 물통에 옮겨 담아서 나온다.
실험결과 예


결과해석
western blot으로 TRP-1, TRP-2 단백질 발현을 관찰하였다. 시험물질은 tyrosinase, TRP-1 단백질 발현을 저해하는 것으로 나타났으나, TRP-2 단백질 발현에는 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.
참고문헌 1. 심관섭, 김진화, 이범천, 이동환, 이근수, 표형배, B16 Melanoma 세포에서 돌나물 추출물의 멜라닌 생성 저해 효과, 대한약학회지, 52(3) p165-171, 2008
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