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체지방감소

동물실험법

제목 혈청 중성지방 측정
구분 체지방감소 링크 주 바이오마커 및 생화학적 인자
실험배경
중성지방(triglyceride)은 체내에 저장되는 지질의 형태이다. 비만의 경우, 과도한 에너지의 섭취로 인하여 간에서 VLDL(very low density lipoprotein, 초저밀도지단백질) particle 분비가 많아지고, 결국 혈액 중 중성지방 농도가 상승하게 된다.
실험재료
필요장비 및 소모품
분광광도계, 항온수조, 시험관(test tube), pipette, pipette tips, cuvette
 
필요시약
TG 측정용 kit  
세포주
 
실험방법 1. 효소비색법을 이용한 kit 시약을 사용하여 분석한다.
2. 증류수(blank), 중성지방 표준액, 혈청 시료를 각각 20 μl 준비한다.
3. 반응액을 3 ml을 첨가하고 잘 혼합한다.
4. 37℃에서 5분간 반응시킨다.
5. 505 nm에서 흡광도를 측정한다.
6. 표준액의 흡광도과 비교하여 중성지방 함량을 계산한다.
계산법: (혈청 흡광도/표준시약 흡광도) X 300 
결과해석
흡광도가 높을수록 혈청의 중성지방의 양이 높은 것을 의미한다. 항비만 소재 공급로 인한 혈중 중성지방 수준의 감소는 비만으로 인한 비이상적인 혈중 중성지방 수준 증가와  간 중성지방 합성에 영향을 미친 것으로 판단할 수 있다.
참고문헌 1. Nägele U, Hägele EO, Sauer G, Wiedemann E, Lehmann P, Wahlefeld AW, Gruber W, Reagent for the enzymatic determination of serum total triglycerides with improved lipolytic efficiency, J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 22(2) p165-174, 1984
2. Bucolo G, David H, Quantitative determination of serum triglycerides by the use of enzymes, Clin. Chem., 19(5) p476-482, 1973
3. Zhu Y, Jong MC, Frazer KA, Gong E, Krauss RM, Cheng JF, Boffelli D, Rubin EM., Genomic interval engineering of mice identifies a novel modulator of triglyceride production, Proc. Natl. Acad. Sci., 97(3) p1137-1142, 2000
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제목 혈청 중성지방 측정 링크 주 바이오마커 및 생화학적 인자
실험재료
필요장비 및 소모품
분광광도계(Jasco), 항온수조(BÜCHI), 시험관(Falcon), pipette(Eppendorf), pipette tips (Eppendorf), cuvette(Agilent Technologies)
 
필요시약
트리글리자임_브이(신양화학약품)
 
실험방법
본 시험법은 TG 측정용 kit를 사용한 것으로, 중성지방 및 그 사구분해물들의 반응을 촉매하는 효소들의 작용으로 생성되는 적색 퀴논 색소를 분광광도계로 측정하는 방법이다.
 
                                  Lipoprotein lipase
Triglyceride +3H2O -------------------> Glycerol +Fatty Acids
                             Glycerol kinase
Glycerol + ATP ----------------------> Glycerol-3-Phosphate + ADP
                                                Glycerol phosphate oxidase
Glycerol-3-Phosphate + O2-----------------------------> Dihydroxyacetone Phophate + H2O2
                                                                     Peroxidase
H2O2 + 4-아미노안티피린+p-Chlorophenol------------------> 적색 키논
이 적색의 키논형 색소를 505 nm에서 측정하여 중성지방의 농도를 구한다.
 
1. 혈청 시료를 준비한다. 혈청시료가 냉동상태이면 냉장온도에서 두어 녹여 놓는다.
간혹 혈청에 부유물이 생기기도 하므로 이 경우에는 centrifuge하여 상층액을 사용하도록 한다.
2. 발색시약과 효소시약 A, B를 섞어 혼합시약을 준비한다. 이때 효소시약 A와 B를 순서대로 녹이며, 모든 시약이 고루 잘 녹을 수 있도록 vortex를 충분히 한다.
3. 항온수조를 37℃로 setting한다.
4. 라벨한 시험관에 혈청 20 μl를 넣는다. 이 때 blank와 표준용액도 준비한다.
5. 혼합한 효소반응액 3 ml를  각각의 시험관에 넣고 vortex한다.
6. 37℃ 항온수조에서 5분간 반응시킨다.
7. 시험관을 항온수조에서 꺼내어 반응을 종결시킨다.
8. 분광광도계를 이용하여 505 nm 파장에서 흡광도를 60분 이내로 측정한다.
Tips :
- Blank를 측정하여 흡광도 값을 0으로 맞춘다.
- 일반적으로 중성지방 300 mg/dl의 흡광도는 0.262 정도이다.
- Kit는 효소를 함유하고 있기 때문에 반드시 냉장보관한다.
- 조제한 효소반응액은 2~8℃ 보존에서 1주간 사용할 수 있다
- 자동분석기를 이용하여 분석할 수 있다.
실험결과 예

결과해석
항비만 소재가 함유된 고지방식이를 공급받은 군의 혈청 중성지방 수준이 고지방식이군에 비하여 낮아, 고지방식이에 의해 증가된 혈청 중성지방 수준을 낮추는 효과가 있는 것으로 판단된다.
참고문헌
첨부파일
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