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체지방감소

동물실험법

제목 혈청 총콜레스테롤 측정
구분 체지방감소 링크 주 바이오마커 및 생화학적 인자
실험배경
비만인의 혈액 내 총 콜레스테롤 수준 정상인에 비해 높다고 보고되고 있으며, 이는 low density lipoprotein (LDL) receptor의 작용 저하와 과도한 very low density lipoprotein(VLDL) 생성 등에 따른 것으로 설명되고 있다.
실험재료
필요장비 및 소모품
분광광도계, 항온수조, 시험관(test tube), pipette, pipette tips, cuvette
 
필요시약
총콜레스테롤 측정용 kit
 
세포주
 
실험방법
1. 효소비색법을 이용한 kit 시약을 사용하여 분석한다.
2. 증류수(blank), 중성지방 표준액, 혈청 시료를 각각 20 μl 준비한다.
3. 반응액을 3 ml을 첨가하고 잘 혼합한다.
4. 37℃에서 5분간 반응시킨다.
5. 505 nm에서 흡광도를 측정한다.
6. 표준액의 흡광도과 비교하여 중성지방 함량을 계산한다.
계산법: (혈청 흡광도/표준시약 흡광도) X 300
결과해석
흡광도가 높을수록 혈청 중 총콜레스테롤 함량이 높은 것을 의미한다. 비만으로 인한 과다한 총콜레스테롤 농도는 동맥경화, 심장질환 등의 위험인자이다.   
참고문헌 1. Richmond W, Preparation and properties of a cholesterol oxidase from Nocardia sp. and its application to the enzymatic assay of total cholesterol in serum, Clin. Chem., 19(12) p1350-1356, 1973
2. Allain CC, Lucy S. Poon LS, Chan CSG, Richmond W, Fu PG, Enzymatic determination of total serum cholesterol, Clin. Chem., 20() p470-475, 1974
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제목 혈청 총콜레스테롤 측정 링크 주 바이오마커 및 생화학적 인자
실험재료
필요장비 및 소모품
분광광도계(Jasco), 항온수조(BÜCHI), 시험관(Falcon), pipette(Eppendorf), pipette tips (Eppendorf), cuvette(Agilent Technologies)
 
필요시약
콜레스테자임-브이(신양화학약품)
 
실험방법
본 시험법은 총콜레스테롤 측정용 kit를 사용한 것으로 콜레스테롤-에스터를 콜레스테롤 에스터분해효소(cholesterol esterase)에 의해 가수분해하고, 이후 콜레스테롤 산화효소(cholesterol oxidase)와 과산화효소(peroxidase)에 의해 생성되는 적색 퀴논색소를 분광광도계를 이용하여 측정한다. 효소작용의 의한 적색 퀴논 생성 과정은 다음과 같다.
                                        Cholesterol esterase
H2O + Cholesterol Ester -----------------------> free Cholesterol + 지방산
                                        Cholesterol oxidase
Free Cholesterol + O2 ------------------------> Cholest-4-en-3-one +H2O2
                                                        Peroxidase
2H2O2 + 4-아미노안티피린 + 페놀 ----------------> 적색 Quinone
이 적색의 Quinone을 파장 505 nm에서 측정하여 총콜레스테롤의 농도를 계산한다.
 
1. 혈청 시료를 준비한다. 혈청시료가 냉동상태이면 냉장온도에서 두어 녹여 놓는다.
간혹 혈청에 부유물이 생기기도 하므로 이 경우에는 centrifuge하여 상층액을 사용하도록 한다.
2. 발색시약과 효소시약 A, B를 섞어 혼합시약을 준비한다. 이때 효소시약 A와 B를 순서대로 녹이며, 모든 시약이 고루 잘 녹을 수 있도록 vortex를 충분히 한다.
3. 항온수조를 37℃로 setting한다.
4. 라벨한 시험관에 혈청 20 μl를 넣는다. 이 때 blank와 표준용액도 준비한다.
5. 혼합한 효소반응액 3 ml를  각각의 시험관에 넣고 vortex한다.
6. 37℃ 항온수조에서 5분간 반응시킨다.
7. 시험관을 항온수조에서 꺼내어 반응을 종결시킨다.
8. 분광광도계를 이용하여 505 nm 파장에서 흡광도를 60분 이내로 측정한다.
Tips :
- Blank를 측정하여 흡광도 값을 0으로 맞춘다.
- 일반적으로 중성지방 300 mg/dl의 흡광도는 0.330 정도이다.
- Kit는 효소를 함유하고 있기 때문에 반드시 냉장보관한다.
- 조제한 효소반응액은 2~8℃ 보존에서 4주간 사용할 수 있다
- 자동분석기를 이용하여 분석할 수 있다.
 
실험결과 예


결과해석
항비만 소재가 함유된 고지방식이를 공급받은 군의 혈청 총 콜레스테롤 수준이 고지방식이군에 비하여 낮아, 고지방식이에 의해 증가된 혈청 콜레스테롤 수준을 낮추는 효과가 있는 것으로 판단된다.
참고문헌
첨부파일
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