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체지방감소

동물실험법

제목 혈청 HDL-콜레스테롤 측정
구분 체지방감소 링크 주 바이오마커 및 생화학적 인자
실험배경
High density lipoprotein(HDL)-콜레스테롤은 말초조직의 콜레스테롤을 간으로 이동시키는 역할을 하는 지단백질이다. 비만인의 경우 낮은 HDL-콜레스테롤 수준을 보이는데, 이는 1) cholesterol ester transfer protein (CETP) 활성 증가로 HDL에서 apoB containing lipoprotein으로 콜레스테롤 이동 증가 2) hepatic lipase 또는 endothelial lipase 활성 증가에 따른 HDL의 hypercatabolism 3) 간에서 scavenger receptor-B1(SR-B1)에 의한 HDL uptake 증가 등으로 설명되고 있다. 비만에 따른 비정상적인 지질수준의 변화는 심혈관질환 등의 위험요인이 될 수 있기 때문에 혈중 지질 수준을 관찰하는 것은 중요하다.
실험재료
필요장비 및 소모품
분광광도계, 항온수조, 시험관(test tube), pipette, pipette tips, cuvette
 
필요시약
HDL 콜레스테롤 측정용 kit
 
세포주
 
실험방법
1. 효소비색법을 이용한 kit 시약을 사용하여 분석한다.
2. 증류수(blank), 중성지방 표준액, 혈청 시료를 각각 20 μl 준비한다.
3. 혈청과 침전시액을 혼합하여 상온에서 10분간 방치한다.
4. 반응액을 3 ml을 첨가하고 잘 혼합한다.
5. 37℃에서 5분간 반응시킨다.
6. 555 nm에서 흡광도를 측정한다.
7. 표준액의 흡광도과 비교하여 HDL-콜레스테롤 함량을 계산한다.
계산법: (혈청 흡광도/표준시약 흡광도) X 100 
결과해석
흡광도가 높을수록 혈청 중 HDL-콜레스테롤 함량이 높은 것을 의미한다. 비만으로 인한 낮은 HDL 수준은 심혈관질환의 위험요인이다.
참고문헌 1. Viikari J, Precipitation of plasma lipoproteins by PEG 6000 and its evaluation with electrophoresis and ultracentrifugation, Scand. J. Clin. Lab. Invest., 36(3) p265-268, 1976
2. Demacker PN, Hijmans AG, Vos-Janssen HE, van’t Laar A, Jansen AP, A study of the use of polyethylene glycol in estimating cholesterol in high density lipoprotein, Clin. Chem., 26(1) p1775-1779, 1980
3. Widhaim K, Pakosta R, Precipitation with polyethylene glycol and density-gradient ultracentrifugation compared for determining high-density lipoprotein subclasses HDL2 and HDL3, Clin. Chem., 37(2) p238-240, 1991
4. Mooradian AD, Haas MJ, Wehmeier KR, Wong NC., Obesity-related changes in high-density lipoprotein metabolism., Obesity, 16(6) p1152-1160, 2008
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제목 혈청 HDL-콜레스테롤 측정 링크 주 바이오마커 및 생화학적 인자
실험재료
필요장비 및 소모품
분광광도계(Jasco), 항온수조(BUCHI), 시험관(Falcon), pipette(Eppendorf), pipette tips(Eppendorf), cuvette(Agilent Technologies)
 
필요시약
에이치디엘-시555(신양화학약품)  
실험방법
본 시험법은 HDL 콜레스테롤  측정용 kit를 사용한 것으로 분석법에 대한 실험원리는 다음과 같다. 본 시험법은 Phosphotungstic acid-MgCl2법을 개량한 것으로 혈청에 인텅그스텐산나트륨 및 염화마그네슘으로 된 침전시약을 가하면 chylomicron, VLDL, LDL은 인텅그스텐나트륨 및 염화마그네슘이온과 결합하여 침전을 형성하여 2가의 금속이온에 의해 아스코르빈산은 산화되므로 측정에 있어 그 영향을 피하게 된다. 상등액 중에 잔존하는 HDL 콜레스테롤을 효소법으로 측정하여 혈청 HDL 콜레스테롤이 측정된다.
 
1. 혈청 시료를 준비한다. 혈청시료가 냉동상태이면 냉장온도에서 두어 녹여 놓는다.
간혹 혈청에 부유물이 생기기도 하므로 이 경우에는 centrifuge하여 상층액을 사용하도록 한다.
2.항온수조를 37℃로 setting한다.
3. 라벨한 시험관에 혈청 200 μl와 침전시액 200 μl를 넣고, 상온에 10분간 방치한다.
4. 3,000rpm에서 10분간 원심분리하고 상층액을 새로운 test tube에 50 μl씩 옮긴다.
Tips:
- blank와 표준물질도 각각 50 μl 취한다.
- 필요한 경우에 표준물질을 희석하여 여러 농도로 측정 후 standard curve를 그리도록 한다.
5. 혼합한 효소반응액 3 ml를  각각의 시험관에 넣고 vortex한다.
6. 37℃ 항온수조에서 5분간 반응시킨다.
7. 시험관을 항온수조에서 꺼내어 반응을 종결시킨다.
8. 분광광도계를 이용하여 555 nm 파장에서 흡광도를 60분 이내로 측정한다.
Tips :
- Blank를 측정하여 흡광도 값을 0으로 맞춘다.
- 일반적으로 중성지방 100 mg/dl의 흡광도는 0.380 정도이다.
- Kit는 효소를 함유하고 있기 때문에 반드시 냉장보관한다.
- 조제한 효소반응액은 2~8℃ 보존에서 4주간 사용할 수 있다.
- 총 콜레스테롤 함량 중 HDL-콜레스테롤이 차지하는 비율로도 계산할 수 있다.
계산법:  Ratio= HDL-콜레스테롤/총콜레스테롤
실험결과 예
출처 : Azman et al, 2011
결과해석
항비만 소재가 함유된 고지방식이를 공급받은 군의 혈청 HDL-콜레스테롤 수준이 고지방식이군에 비하여 높아, 고지방식이에 의해 감소된 혈청  HDL-콜레스테롤 수준을 높이는 효과가 있는 것으로 판단된다.
참고문헌 1. Azman KF, Amom Z, Azlan A, Esa NM, Ali RM, Shah ZM, Kadir KK, Antiobesity effect of Tamarindus indica L. pulp aqueous extract in high-fat diet-induced obese rats., J. Nat. Med., 66(2) p333-342, 2011
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