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체지방감소

동물실험법

제목 혈청 non-esterified fatty acid 측정
구분 체지방감소 링크 주 바이오마커 및 생화학적 인자
실험배경
유리지방산 (free fatty acid)과 같은 뜻으로 지방조직에서 방출되어서 심근, 기타 조직에서 에너지원으로서 이용된다. 비만인의 경우, 혈액 중 유리지방산 수준은 정상인에 비해 높으며, 이는 lipoprotein lipase 활성 증가, 유리지방산의 clearance 감소에 따른 것으로 설명하고 있다. 증가된 유리지방산은 인슐린의 anti-lipolytic action을 저해하여 결과적으로 circulation되는 유리지방산의 비율은 더욱더 증가하게 된다. 혈청 유리지방산은 비만 뿐만 아니라 인슐린저항성, 염증 등과 상관성이 있는 것으로 알려져 있기 때문에 혈중 유리지방산 수준을 관찰하는 것은 중요하다. 
실험재료
필요장비 및 소모품
분광광도계, 항온수조, 시험관(test tube), pipette, pipette tips, cuvette 
 
필요시약
Non-esterified fatty acid 측정용 kit 
세포주
 
실험방법
1. 효소비색법을 이용한 kit 시약을 사용하여 분석한다.
2. 증류수(blank), non-esterified fatty acid 표준액, 혈청 시료를 준비한다.
3. 반응액을 첨가하여, 37℃에서 5분간 반응시킨다.
4. 546 nm에서 흡광도를 측정한다.
5. 표준액의 흡광도과 비교하여 non-esterified fatty acid 함량을 계산한다.
계산법: (혈청 흡광도/표준시약 흡광도) X 1000 
결과해석 흡광도가 높을수록 혈청 중 non-esterified fatty aicd 함량이 높은 것을 의미한다.
참고문헌 1. Okabe H, Uji Y, Nagashima K, Noma A, Enzymic determination of free fatty acids in serum, Clin. Chem., 26(11) p1540-1543, 1980
2. Hales CN, Plasma-levels of glucose, non-esterified fatty acid, glycerol, and insulin four years before the onset of diabetic ketosis, Lancet, 19(2) p389-390, 1967
3. Oh KS, Kim M, Lee J, Kim MJ, Nam YS, Ham JE, Shin SS, Lee CM, Yoon M, Liver PPARα and UCP2 are involved in the regulation of obesity and lipid metabolism by swim training in genetically obese db/db mice, Biochem. Biophys. Res. Commun., 345(3) p1232-2239, 2006
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제목 혈청 non-esterified fatty acid 측정 링크 주 바이오마커 및 생화학적 인자
실험재료
필요장비 및 소모품
분광광도계(Jasco), 항온수조(BÜCHI), 시험관(Falcon), pipette(Eppendorf), pipette tips (Eppendorf), cuvette(Agilent Technologies) 
 
필요시약
시크디아 네파자임(신양화학약품)
 
 
실험방법
1. 혈청중의 유리지방산에 CoA와 ATP를 보효소로 하는 ACS가 작용하여 AcylCoA, AMP 및 Pyrophosphoric Acid(PPi)을 생성한다.
                          ACS, Mg2-
RCOOH + ATP ---------------> RCO-CoA(AcylCoA) + AMP + PPi
2. 생성된 AcylCoA에 ACOD가 작용하여 2,3-Trans-enoyl-CoA 및 과산화효소를 생성한다.
                                          ACOD
RCO-CoA + O2 + CoA ---------------->R’CH = CHCO-CoA + H2O2
ACS 반응 후에 남아있는 CoA는 정색반응을 저해하므로(ACOD-POD) 반응시에 3-Octene산을 작용시켜 CoA에 의한 저해를 제거한다.
                                             ACS, Mg2-
3-octene산 + ATP + CoA ---------------> 3-OctenyCoA + AMP + PPi
여기에서 생성된 3-OctenylCoA는 2개의 반응기질로 되어져있기 때문에 CoA가 속히 제거된다.
3. 정량적으로 생성된 과산화수소는 과산화효소의 작용으로 4-아미노안티피린과 TOOS를 산화축합하여 자색의 키논색소를 생성한다. 이 자색의 카논색소의 흡광도를 측정하여 유리지방산치를 구한다.
                                                            POD
2H2O2 + 4-아미노안티피린 + TOOS -----------> 자색키논색소
 
이 자색의 키논색소의 흡광도를 측정하여 유리지방산을 구한다.
*ACS ; Acyl coenzyme A synthetase
*ATP ; Adenosine-5’-triphosphate, Disodium Salt
*ACOD ; Acyl Coenzyme A oxidase
*POD ; Peroxidase
*TOOS ; N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfooropyl)-m-toruidine
 
1. 혈청 시료를 준비한다. 혈청시료가 냉동상태이면 냉장온도에서 두어 녹여 놓는다.
간혹 혈청에 부유물이 생기기도 하므로 이 경우에는 centrifuge하여 상층액을 사용하도록 한다. 
2. 발색시약과 효소시약 섞어 혼합시약을 준비한다.
3. 항온수조를 37℃로 setting한다.
4. 라벨한 시험관에 혈청 7 μl를 넣는다. 이 때 blank와 표준용액도 준비한다.
Tips :
- 필요한 경우에 표준용액을 희석하여 여러 농도로 측정 후 standard curve를 그리도록 한다.
5. 혼합한 효소반응액(NEFA 시약-1) 260 μl를 각각의 시험관에 넣고 vortex한다.
6. 37℃ 항온수조에서 5분간 반응시킨다.
7. 혼합한 효소반응액(NEFA시약-2) 130 μl를 각각의 시험관에 넣고 vortex한다.
8. 37℃ 항온수조에서 5분간 반응시킨다.
9. Spectrometer를 이용하여 546 nm 파장에서 흡광도를 60분 이내로 측정한다.
Tips :
- Blank를 측정하여 흡광도 값을 0으로 맞춘다.
- Kit는 효소를 함유하고 있기 때문에 반드시 냉장보관한다.
- 조제한 효소반응액은 2~8℃ 보존에서 1달간 사용할 수 있다.
실험결과 예
결과해석
고지방식이에 기능성 소재가 혼합된 식이를 공급받은 군의 혈청 중 non-esterified fatty acid 농도가 고지방식이군보다 낮아, 혈중 유리지방산 농도를 낮추는 효과가 있다고 판단할 수 있다.
 
참고문헌
첨부파일
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