국민의 더 안전하고 건강한 삶을 위한
건강기능식품 플랫폼

  • 통합검색
  • 인정현황
  • 내게맞는실험법
  • 기능지표성분분석법
  • top

체지방감소

동물실험법

제목 혈청 인슐린 측정
구분 체지방감소 링크 주 바이오마커 및 생화학적 인자
실험배경
지방세포는 인슐린에 민감한 세포이고, 인슐린은 지방세포(adipocyte)에서 "중성지방의 저장", "지방전구세포에서 지방세포로의 분화", "포도당 이동 및 중성지방 합성(lipogenesis)", "lipolysis 억제" 등의 역할을 한다. 혈액 중 인슐린 증가는 지방세포에서 간으로의 유리지방산 이동을 증가시켜 지방합성을 촉진시키는 반면, 지방산화는 억제되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 항비만 소재를 공급한 비만한 실험동물에서 혈중 인슐린 농도를 체중조절의 기전을 설명하는 바이오마커로 활용할 수 있다. 
실험재료
필요장비 및 소모품
ELISA reader, multipipette, pipette, pipette tip, rotary shaker  
필요시약
인슐린 ELISA kit
 
세포주
 
실험방법
1. 분석 시약과 혈청을 준비한다.
2. Microplate의 각 well에 혈청 및 표준물질을 첨가한다.
3. 각 well에 HRP-labeled monoclonal anti-insulin conjugate를 넣은 후, 상온에서 2시간 반응시킨다.
4. Washing한다.
5. Substrate solution을 첨가한 후, 상온에서 30분간 반응시킨다.
6. Stop solution를 첨가하여 반응을 정지시킨다.
7. 450nm에서 흡광도를 측정한다.
결과해석
흡광도가 높을수록 혈청 내 인슐린 함량이 높은 것을 의미하며, 조직 내 지방축적 및 당, 지방대사와 연관지어 설명할 수 있다.  
참고문헌 1. Ashby J, Frier, B, Circulating C-peptide: measurement and clinical applications, Ann. Clin. Biochem., 18() p125, 1981
2. Beischer W, Proinsulin and C-peptide in humans. hormones in normal and abnormal human tissues, Volume 3K, Fotherby and Pal, S., ed. (Berlin: Walter DeGruyter)., () p1-43, 1983
3. Beyer J, Krause V. Cordes V, C-peptide: its biogenesis, structure, determination and clinical significance, Giornale. Italiano. di Chimica. Clinica. 4 Supp, 9() p22, 1979
4. Bonger A, Garcia-Webb P, C-peptide measurement: methods and clinical utility, Crit. Rev. Clin. Lab. Sci., 19(4) p297-352, 1984
5. Chevenne D, Ruiz J, Lohmann L, Laudat A, Leblanc H, Gray IP, Passa P, Porquet D, Immunoradiometric assay of human intact proinsulin applied to patients with type 2 diabetes, impaired glucose tolerance, and hyperandrogenism, Clin. Chem., 40(5) p754, 1994
6. Bowsher RR, Wolny JD, Frank BH, A rapid and sensitive radioimmunoassay for the measurement of proinsulin in human serum, Diabetes, 41(9) p1084-1090, 1992
7. Kao PC, Taylor RL, Service FJ, Proinsulin by Immunochemiluminometric assay for the diagnosis of insulinoma, J. Clin. Endocrinol. Metab., 78(5) p1048-1051, 1994
8. Dhahir FJ, Cook DB, Self CH, Amplified enzyme-linked immunoassay of human proinsulin in serum (detection limit: 0,1 pmol/L), Clin. Chem., 38(2) p227-232, 1992
목록보기
제목 혈청 인슐린 측정 링크 주 바이오마커 및 생화학적 인자
실험재료
필요장비 및 소모품
ELISA reader(TECAN), multipipette(Eppendorf), pipette(Eppendorf), Rotary shaker(OP-100) 
 
필요시약
인슐린 ELISA kit(Insulin ultrasensitive ELISA, ALPCO Diagnostics)  
실험방법
 본 시험법에서 소개하고 있는 시험방법은 면역분석법이다. 이 측정 kit는 두 개의 단일항체가 인슐린 분자에 대한 별개의 항원결정인자에 대항하여 직접 결합하는 direct sandwich technique 이다. 반응과정 중에 샘플에 존재하는 인슐린은 well에 미리 코딩되어 있는 anti-insulin antibody와 enzyme (HRP)-conjugated anti-insulin antibody와 결합한다. 간단한 워싱 단계로 결합되지 않은 enzyme labeled antibody를 제거할 수 있다. 결합된 HRP 복합체는 TMB substrate와의 반응을 통해 검출된다. 이 검출반응은 산을 첨가하는 것에 의해 중지되며 ELISA reader를 이용하여 colormetic endpoint 값을 구할 수 있게 된다.
 
1. 모든 시약을 분석하기 전에 미리 상온에 꺼내둔다.
Tips :
- 혈청은 냉장온도를 유지시킨다.
- 인슐린같은 호르몬은 체외에서 빠르게 분해될 수도 있기 때문에 보관에 주의하도록 하며, 가능한한 빠른 시간내로 분석하도록 한다.
2. 인슐린 표준물질을 농도별(0.025, 0.063, 0.188, 0.5, 1.25, 3.75, 6.9 ng/ml)로 준비한다.
3. Microplate의 각 well에 혈청, 표준물질 5 μl을 첨가한다.
Tips :
- 혈청의 인슐린이 처리된 표준물질의 농도 범위 외로 나온 경우에는 희석을 하여 범위 내로 나오도록 한다. 
4. 각 well에 conjugate 75 μl을 첨가한 후, plate cover를 덮은 채로 상온에서 2시간 반응시킨다.
5. Well에 있는 용액을 제거한다.
6. Wash buffer 200 μl를 각 well에 넣어 washing한다(6번 반복).
Tips :
-  Wash buffer를 매우 빠른 속도로 plate를 뒤집어서 제거한다. 이때, 각 well에 wash buffer가 튀지 않도록 유의한다. 마지막에는 microplate를 뒤집어서 paper towel에 탁탁 털어내어 거품까지 완전히 제거한다.
- 거품이 잘 제거되지 않는 경우에는 니들이나 팁 끝으로 터뜨려 완전히 제거되도록 한다.
7. TMB substrate solution 100 μl를 넣은 후, 상온에서 30분간 반응시킨다.
8. Stop solution 100 μl씩 넣어 반응을 정지시킨다.
9. ELISA reader를 이용하여 450 nm 파장에서 30분 이내로 흡광도를 측정한다.
실험결과 예
결과해석
항비만 소재가 함유된 고지방식이를 공급받은 군의 혈청 인슐린 함량이 고지방식이군에 비해 낮아, 고지방식이에 의해 증가된 혈청 인슐린 농도를 낮추는 효과가 있는 것으로 판단된다.
참고문헌
첨부파일
목록보기