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혈행개선

동물실험법

제목 Thromboxane A2 농도 측정
구분 혈행개선 링크 혈소판 활성, 혈액응고
실험배경

TXA2는 혈소판이 활성화되었을 때 혈소판응집작용을 하는 프로스타글란딘(prostagladins) 중 하나이다. 세포막 인지질에 존재하는 아라키돈산(arachidonic acid)을 기질로 하여 사이클로옥시지나아제(cyclooxygenase)에 의해 프로스타글란딘(prostaglandin) H2가 생성되는데, 이로부터 TXA2가 합성된다. TXA2는 반감기가 짧으므로 안정한 대사체인 TXB2 (TXA2의 최종 대사산물)를 정량하는 간접적인 방법으로 혈소판의 활성화 정도를 측정한다. 즉, 혈액이나 소변의 TXB2 및 TXB2 대사물의 수준을 측정함으로써 TXA2의 수준을 예측할 수 있다.

실험재료
필요장비 및 소모품

주사기, 원심분리기, pipette, pipette tip, platic tube

 
필요시약

Heparin, EIA kits

 
세포주

Rat

 
실험방법

1. 동물로부터 혈액을 채취한다.

2. 채취한 혈액을 4000rpm으로 5분간 centrifuge한다.

3. TXA2는 안정한 대사체인 TXB2(thromboxane B2.를 측정하여 계산하며, Cayman에서 제공하는 kit에서 지시하는 방법에 의거하여 수행한다. 자세한 방법은 다음과 같다.

1) 96 well plate에 TXB2 항체를 50ul씩 넣고 냉장고에 O/N으로 둔다.

2) TXB2 항체를 털어낸 후 plasma를 각각 100ul 씩 넣어 상온에서 2시간 동안 반응시킨다.

3) Biotin-conjugated TXB2 항체를 100ul 씩 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시킨다.

4) Avidin-conjugated horseradish peroxidase를 100ul 씩 넣고 상온에서 30분간 반응시킨다.

5) TMB를 100ul 씩 넣고 상온에서 반응시키면서 색의 변화를 관찰한다. 

6) Standard curve의 색이 gradient하게 바뀌면 stop solution(H2SO4.을 50ul 씩 넣어 반응을 종결시킨다. 

7) ELISA reader를 이용하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정한다.

결과해석

TXA2는 혈소판 응집을 촉진하므로, TXA2의 분비를 억제하는 소재는 혈행 개선 효능이 있을 것으로 생각할 수 있다. TXA2/PGI2의 비율로써 계산되는 경우 비율이 낮을수록 혈행 개선 효능이 있을 것으로 생각할 수 있다.

참고문헌 1. Yu C, Qi D, Lian W, Li QZ, Li HJ, Fan HY, Effects of danshensu on platelet aggregation and thrombosis: in vivo arteriovenous shunt and venous thrombosis models in rats, PLoS One. 9(11):e110124, 2014
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제목 Thromboxane A2 농도 측정 링크 혈소판 활성, 혈액응고
실험재료
필요장비 및 소모품

주사기(BD falcon), 원심분리기(Sorvall fresco), pipette(Thermo scientific), pipette tip(QSP), plastic tube(BD flacon)

 
필요시약

Heparin(Jiangsu Wanbang Biochemical Medicine), EIA kits(Tianjin Jiuding Engineering of Medicine and Biology)

 
실험방법

1. 동물로부터 혈액을 채취한다.

2. 채취한 혈액을 4000rpm으로 5분간 centrifuge하여 plasma를 취한다.

3. TXA2는 안정한 대사체인 TXB2(thromboxane B2.를 측정하여 계산하며, Cayman에서 제공하는 kit에서 지시하는 방법에 의거하여 수행한다. 자세한 방법은 다음과 같다.

1) 96 well plate에 TXB2 항체를 50ul씩 넣고 냉장고에 O/N으로 둔다.

2) TXB2 항체를 털어낸 후 plasma를 각각 100ul 씩 넣어 상온에서 2시간 동안 반응시킨다.

3) Biotin-conjugated TXB2 항체를 100ul 씩 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시킨다.

4) Avidin-conjugated horseradish peroxidase를 100ul 씩 넣고 상온에서 30분간 반응시킨다.

5) TMB를 100ul 씩 넣고 상온에서 반응시키면서 색의 변화를 관찰한다. 

6) Standard curve의 색이 gradient하게 바뀌면 stop solution(H2SO4.을 50ul 씩 넣어 반응을 종결시킨다. 

7) ELISA reader를 이용하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정한다.

실험결과 예


출처: Yu C et al., 2014 

결과해석

Aspirin 또는 Danshensu에 의해 TXA2의 안정한 대사체인 TXB2의 농도가 감소하였으므로, aspirin 또는 Danshensu는 혈행 개선 효능을 보일 것으로 생각된다.

참고문헌 1. Yu C, Qi D, Lian W, Li QZ, Li HJ, Fan HY, Effects of danshensu on platelet aggregation and thrombosis: in vivo arteriovenous shunt and venous thrombosis models in rats, PLoS One. 9(11):e110124, 2014
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