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혈행개선

동물실험법

제목 혈소판 응집반응 측정
구분 혈행개선 링크 혈소판 활성, 혈액응고
실험배경

혈소판 응집 반응은 agonist 또는 전단응력에 의해 응집된다. 혈소판 응집이 과도하게 일어나면 혈행 장애가 일어나게 되므로 혈소판 응집은 혈행 개선의 바이오마커로 사용될 수 있다. 혈소판 응집을 일으키는 agonist로는 thrombin, ADP, collagen, 혈소판활성인자, serotonin 등이 있다.
실험재료
필요장비 및 소모품

분광광도계, 항온수조, 자외가시광선 큐벳

 
필요시약

세척 혈소판, 트롬빈, 콜라겐, ADP 

 
세포주

Rat, mouse

 
실험방법

1. 실험 시 필요한 응집촉진물질을 만든다.  

2. 최종적으로 3 x 108 개/ml가 되도록 현탁 완충액으로 조정한 세척 혈소판(washed platelet)을 준비한다.

3. 자외가시광선 큐벳에 세척 혈소판(washed platelet) 현탁액을 넣고 시험 물질을 농도별로 넣어준다.

4. 37℃에서 3분간 교반하면서 전항온처리(preincubation)시킨 후 660nm에서 흡광도를 측정한다.

5. 그 후 0.1U/ml의 트롬빈과 5μg/ml의 콜라겐으로 자극시켜 5분 동안 응집반응을 시킨 후 다시 660nm에서 흡광도를 측정한다.

- 결과 계산 : T=  1/10△A , T : 투과도, △A : 5A-3A

(5A  : 응집반응 5분 후의 흡광도, 3A  : 응집반응 전 전항온처리 3분 후의 흡광도)
결과해석

전항온처리 3분 후(응집반응 전)와 응집반응 5분 후 두 차례 660nm의 투과도를 측정하여 투과도(T)를 계산하여 응집정도를 %로 나타낸다. 참조값으로써 현탁완충액(흡광도 0.을 사용한다.
참고문헌 1. Lee JH, Park HJ, Effects of Lipophilic Fraction from Korean Red Ginseng on Platelet Aggregation and Blood Coagulation in Rats Fed with Corm Oil and Beeftallow Diet, Korean J. Ginseng Sci. 19(-):206-211, 1995
2. Choi NS, Choi JH, Yoon JH, Lee SG, Song JJ, Antithrombotic Activities of Cheongkookjang and Cheongkookjang Fermented with Greeg Tea or Mugwort, Korean J. Microbio. 43(4):298-303, 2007
3. Jin YR, Yu JY, Lee JJ, You SH, Chung JH, Noh JY, Im JH, Han XH, Kim TJ, Shin KS, Wee JJ, Yun YP, Antithrombotic and Antiplatelet Activities of Korean Red Ginseng Extract, Basic Clin Pharmacol Toxicol. 100(3):170-5, 2007
4. Prociuk MA, Edel AL, Richard MN, Gravel NT, Ander BP, Dupasquier CMC, Pierce GN, Cholesterol-induced stimulation of platelet aggregation is prevented by a hempseed-enriched diet, Can J Physiol Pharmacol. 86(4):153-9, 2008
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제목 혈소판 응집반응 측정 링크 혈소판 활성, 혈액응고
실험재료
필요장비 및 소모품

분광광도계, 항온수조, 자외가시광선 큐벳(Kartel)

 
필요시약

세척 혈소판, 트롬빈(Sigma), 콜라겐(Sigma), ADP(Sigma) 

 
실험방법

1. 실험 시 필요한 응집촉진물질을 만든다.

Tips:

- 트롬빈 : 100 unit/ml로 분주하여 -70℃에 보관한다. 얼음에 보관하였다가 실험 전에 서서히 녹이고 교반한 후 사용하며 최대의 응집 유도를 위하여 세척 혈소판에서 보통 0.1 unit/ml을 사용한다.

- 콜라겐 : 실험 당일 얼음에 보관하여 사용하며 3-5μg/ml 콜라겐에서 보통 세척 혈소판의 최대 응집을 보인다.

- ADP : 증류수를 가해 희석하여 분주하며 냉장 보관하며 일주일간 사용 가능하다. 5μM(최종 농도)로 희석하여 사용한다.

2. 최종적으로 3 x 108 개/ml가 되도록 현탁 완충액으로 조정한 세척 혈소판(washed platelet)을 준비한다.

3. 자외가시광선 큐벳에 세척 혈소판(washed platelet) 현탁액을 넣고 시험 물질을 농도별로 넣어준다.

4. 37OC에서 3분간 교반하면서 전항온처리(preincubation)시킨 후 660nm에서 흡광도를 측정한다.

5. 그 후 0.1U/ml의 트롬빈과 5μg/ml의 콜라겐으로 자극시켜 5분 동안 응집반응을 시킨 후 다시 660nm에서 흡광도를 측정한다.

Tips:

- 결과 계산 : T=  1/10△A , T : 투과도, △A : 5A-3A

(5A  : 응집반응 5분 후의 흡광도, 3A  : 응집반응 전 전항온처리 3분 후의 흡광도)
실험결과 예


출처: Jin YR et al., 2007 
결과해석

홍삼 추출물을 처리했을 때 혈소판 응집반응이 유의미하게 감소하였으므로, 홍삼 추출물은 혈소판 응집반응을 억제하여 혈행 개선 효능을 보임을 알 수 있음.
참고문헌 1. Jin YR, Yu JY, Lee JJ, You SH, Chung JH, Noh JY, Im JH, Han XH, Kim TJ, Shin KS, Wee JJ, Yun YP, Antithrombotic and Antiplatelet Activities of Korean Red Ginseng Extract, Basic Clin Pharmacol Toxicol. 100(3):170-5, 2007
2. Yun YP, Do JH, Ko SR, Ryu SY, Kim JH, Song HC, Park YD, Ahn KS, Kim SH, Effects of Korean red ginseng and its mixed prescription on the high molecular weight dextran-induced blood stasis in rats and human platelet aggregation, J Ethnopharmacol. 77(2-3):259-64, 2001
3. Yang SA, Im NK, Lee IS, Effects of Methanolic Extract from Salvia miltiorrhiza Bunge on in vitro Antithrombotic and Antioxidative Activities, Korean J. Food SCI. Technol 39(1):p83-87, 2007
4. Noh KH, Park CM, Jang JH, Shin JH, Cho MK, Kim JO, Song YS, Effects of Nattokinase fibrinol supplementation on Fibrinolysis and Atherogenesis, Journal of Life Science 19(-):289-298, 2009
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