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혈행개선

동물실험법

제목 Activated Partial Thromboplastin Time 측정
구분 혈행개선 링크 혈소판 활성, 혈액응고
실험배경

혈액응고 과정은 내인성 경로와 외인성 경로 인자들이 상호 반응하여 일어나지만, 최종적으로는 혈장 단백질인 프로트롬빈이 트롬빈으로 전환되고, 이어서 트롬빈은 피브린 고정인자를 활성화하여 안정화된 혈병을 만드는 것으로 끝이 난다. Thromboplastin은 프로트롬빈이 트롬빈으로 전환되는 것을 돕는 단백질로 응고과정을 촉진한다. Thromboplastin을 변형하여 만들어진 partial thromboplastin은 내인성 경로의 활성을 측정하는 시험에 사용되며, 그 시험방법을 activated partial thromboplastin time(aPTT)이라 한다.

실험재료
필요장비 및 소모품

혈액 응고 측정기, 10ml 주사기, 자석젓개, 가온교반기, 원심분리기

 
필요시약

염화칼슘, 시트르산 나트륨, Hemoliance SynthASilTM APTT Reagent  (Instrumentation Laboratory)

 
세포주

Rat, mouse

 
실험방법

1. 채혈하기 전 항응고제, 3.8% 구연산나트륨(sodium citrate)를 만든다.

2. 20mM 염화칼슘 용액을 만든다.

3. 1.에서 만든 항응고제를 주사기 내로 흡입하여 주사기 내벽을 둘러준다. 항응고제의 양은 뽑을 쥐의 혈액의 양을 고려(항응고제 : 혈액 = 1 : 9.한다.

4. 쥐의 혈액을 채취한다. 

5. 원심분리기 2500rpm에서 15분간 원심분리하며 상등액을 취한다.

6. 냉장보관하고 있던 활성 트롬보플라스틴 측정 시약은 원심분리하는 동안에 상온에서 최소 15분 이상이 되도록 방치한다. 또한 이 때 혈액 응고 측정기를 미리 켜두어 37OC가 되도록 한다.

7. 활성 트롬보플라스틴 측정 시약과 CaCl2 200mM을 1.5ml 튜브(eppen tube)에 옮겨담고 가온교반기를 이용하여 37℃에서 5분 정도 예열한다.

8. 혈장 100㎕를 위하여 혈액 응고 측정기 위의 컵에서 1분간 배양(incubation)한다.

9. 미리 예열시켜 놓았던 활성 트롬보플라스틴 측정 시약 100㎕를 1분간 배양시킨 혈장 위에 급속히 넣고 3분간 배양한다.

10. 미리 37℃에서 예열시켜 놓았던 20mM CaCl2 100㎕를 정확히 3분째 급속히 가하고 혈액 응고 측정기 위의 스톱워치를 눌러서 멈출 때까지의 시간을 측정한다.

11. 모든 과정은 3회 반복 실시하여 평균을 낸다.

결과해석

aPTT가 길수록 혈전이 늦게 생기는 것이므로 혈행이 개선되는 것으로 판단한다.

참고문헌 1. Jin YR, Yu JY, Lee JJ, You SH, Chung JH, Noh JY, Im JH, Han XH, Kim TJ, Shin KS, Wee JJ, Yun YP, Antithrombotic and Antiplatelet Activities of Korean Red Ginseng Extract, Basic Clin Pharmacol Toxicol. 100(3):170-5,2 2007
2. Yun YP, Do JH, Ko SR, Ryu SY, Kim JH, Song HC, Park YD, Ahn KS, Kim SH, Effects of Korean red ginseng and its mixed prescription on the high molecular weight dextran-induced blood stasis in rats and human platelet aggregation, J Ethnopharmacol. 77(2-3):259-64, 2001
3. Yang SA, Im NK, Lee IS, Effects of Methanolic Extract from Salvia miltiorrhiza Bunge on in vitro Antithrombotic and Antioxidative Activities, Korean J. Food SCI. Technol. 39(1):83-87, 2007
4. Noh KH, Park CM, Jang JH, Shin JH, Cho MK, Kim JO, Song YS, Effects of Nattokinase fibrinol supplementation on Fibrinolysis and Atherogenesis, Journal of Life Science. 19(-):289-298, 2009
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제목 Activated Partial Thromboplastin Time 측정 링크 혈소판 활성, 혈액응고
실험재료
필요장비 및 소모품

혈액 응고 측정기, 10ml 주사기(BD falcon), 자석젓개, 가온교반기, 원심분리기(Sorvall fresco)

 
필요시약

염화칼슘(Sigma), 시트르산 나트륨(Sigma), Hemoliance SynthASilTM APTT Reagent  (Instrumentation Laboratory)

 
실험방법

1. 채혈하기 전 항응고제, 3.8% 구연산나트륨(sodium citrate)를 만든다.

2. 20mM 염화칼슘 용액을 만든다.

3. 1.에서 만든 항응고제를 주사기 내로 흡입하여 주사기 내벽을 둘러준다. 항응고제의 양은 뽑을 쥐의 혈액의 양을 고려(항응고제 : 혈액 = 1 : 9.한다.

4. 쥐의 혈액을 채취한다. 

5. 원심분리기 2500rpm에서 15분간 원심분리하며 상등액을 취한다.

6. 냉장보관하고 있던 활성 트롬보플라스틴 측정 시약은 원심분리하는 동안에 상온에서 최소 15분 이상이 되도록 방치한다. 또한 이 때 혈액 응고 측정기를 미리 켜두어 37℃가 되도록 한다.

7. 활성 트롬보플라스틴 측정 시약과 CaCl2 200mM을 1.5ml 튜브(eppen tube)에 옮겨담고 가온교반기를 이용하여 37℃에서 5분 정도 예열한다.

8. 혈장 100㎕를 위하여 혈액 응고 측정기 위의 컵에서 1분간 배양(incubation)한다.

9. 미리 예열시켜 놓았던 활성 트롬보플라스틴 측정 시약 100㎕를 1분간 배양시킨 혈장 위에 급속히 넣고 3분간 배양한다.

10. 미리 37℃에서 예열시켜 놓았던 20mM CaCl2 100㎕를 정확히 3분째 급속히 가하고 혈액 응고 측정기 위의 스톱워치를 눌러서 멈출 때까지의 시간을 측정한다.

11. 모든 과정은 3회 반복 실시하여 평균을 낸다.

실험결과 예


출처: Jin YR et al., 2007 

결과해석

홍삼 추출물을 처리했을 때 APTT가 유의미하게 변하지 않았으므로, 홍삼 추출물은 혈액응고시스템에는 영향을 주지 않음을 알 수 있다.

참고문헌 1. Jin YR, Yu JY, Lee JJ, You SH, Chung JH, Noh JY, Im JH, Han XH, Kim TJ, Shin KS, Wee JJ, Yun YP, Antithrombotic and Antiplatelet Activities of Korean Red Ginseng Extract, Basic&Clinical pharmacology&Toxicology 100(3. p170-175, 2007
2. Yun YP, Do JH, Ko SR, Ryu SY, Kim JH, Song HC, Park YD, Ahn KS, Kim SH, Effects of Korean red ginseng and its mixed prescription on the high molecular weight dextran-induced blood stasis in rats and human platelet aggregation, J Ethnopharmacol. 77(2-3. p259-264, 2001
3. Yang SA, Im NK, Lee IS, Effects of Methanolic Extract from Salvia miltiorrhiza Bunge on in vitro Antithrombotic and Antioxidative Activities, Korean J. Food SCI. Technol. 39(1):83-87, 2007
4. Noh KH, Park CM, Jang JH, Shin JH, Cho MK, Kim JO, Song YS, Effects of Nattokinase fibrinol supplementation on Fibrinolysis and Atherogenesis, Journal of Life Science. 19(-):289-298, 2009
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