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혈행개선

동물실험법

제목 Fibrinogen 단백질 발현 측정
구분 혈행개선 링크 섬유소(원) 용해
실험배경

수용성 섬유소원은 간에서 합성되어 혈액 응괴 형성을 돕는 당단백질로 혈중에 가장 풍부하게 존재하는 혈액 응고 인자이며, 트롬빈에 의하여 불용성 섬유소로 전환된다.
실험재료
필요장비 및 소모품

Gel caster, pipette, pipette tip, plastic tube, orbital shaker 

 
필요시약

BCA protein assay reagent, sample buffer, fibrinogen, thrombin, 12% gel, triton X-100, zymogram reaction buffer, coomassie brilliant blue R-250

 
세포주

Mouse

 
실험방법

1. 동물 조직으로부터 단백질을 추출한다.

2. BCA protein assay reagent로 단백질 농도를 측정한다.

3. 단백질 시료를 5X SDS-PAGE sample buffer와 혼합한다.

4. 100OC로 5분간 끓인다.

5. 0.12%(w/v) fibrinogen과 thrombin(1U/ml)이 함유된 12% polyacrylamide gel에 loading한다.

6. Loading이 끝난 후 2.5% Triton X-100 solution으로 gel을 washing한다.

7. Gel을 zymogram reaction buffer에 넣고 37℃에서 O/N으로 반응시킨다.

8.　Gel을 coomassie Brilliant Blue R-250으로 staining한다.
결과해석

이 방법의 원리는 gel에 함유된 fibrinogen이 분해되는 것을 검출하는 원리이다. Coomassie Brilliant Blue로 염색된 것이 적을수록 fibrinogen이 적어지는 것을 볼 수 있으며, fibrinogen을 감소시키는 물질은 혈행 개선 기능성이 있는 것으로 볼 수 있다. 
참고문헌 1. Kang SR, Choi JH, Kim DW, Park SE, Sapkota K, Kim S, Kim SJ, A bifunctional protease from green alga Ulva pertusa with anticoagulant properties: partial purification and characterization, Journal of Applied Phycology. 28(1):599-607, 2016
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제목 Fibrinogen 단백질 발현 측정 링크 섬유소(원) 용해
실험재료
필요장비 및 소모품

Gel caster, pipette(Thermo scientific), pipette tip(QSP), plastic tube(BD falcon), orbital shaker 

 
필요시약

BCA protein assay reagent(Pierce), sample buffer, fibrinogen(Sigma), thrombin(Sigma), 12% gel, triton X-100(Sigma), zymogram reaction buffer(Zymo Research), coomassie brilliant blue R-250(Thermo Fisher Scientific)

 
실험방법

1. 동물 조직으로부터 단백질을 추출한다.

2. BCA protein assay reagent로 단백질 농도를 측정한다.

3. 단백질 시료를 5X SDS-PAGE sample buffer와 혼합한다.

Tips:

- Sample buffer 조성 : 1M urea, 4% SDS, and 4% β-mercaptoethanol

4. 100℃로 5분간 끓인다.

5. 0.12%(w/v) fibrinogen과 thrombin(1U/ml)이 함유된 12% polyacrylamide gel에 loading한다.

6. Loading이 끝난 후 2.5% Triton X-100 solution으로 gel을 washing한다.

7. Gel을 zymogram reaction buffer에 넣고 37℃에서 O/N으로 반응시킨다.

Tips:

- Zymogram reaction buffer 조성 : 30 mM Tris (pH 7.4. containing 200 mM NaCl,

10 mM CaCl2, and 0.02 % NaN3

8.　Gel을 coomassie Brilliant Blue R-250으로 staining한다.
실험결과 예


출처: Kang SR et al., 2016 
결과해석

후보 소재 처리에 의해 시간이 갈수록 α chain과 β chain이 감소하고 있으므로, 후보 소재는 혈행 개선 기능성이 있다고 보여진다.
참고문헌 1. Kang SR, Choi JH, Kim DW, Park SE, Sapkota K, Kim S, Kim SJ, A bifunctional protease from green alga Ulva pertusa with anticoagulant properties: partial purification and characterization, Journal of Applied Phycology. 28(1):599-607, 2016
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