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혈행개선

동물실험법

제목 섬유소 단량체(Fibrin monomer) / D-이합체(dimer) 형성 측정
구분 혈행개선 링크 섬유소(원) 용해
실험배경

섬유소는 혈액응고 메커니즘의 최종 생성물질로 출혈이 일어났을 때 혈전을 형성하기 위하여 혈소판들을 서로 결합시키는 불용성의 하얀 섬유질로 구성되어 있으며, 수용성 섬유소원이 트롬빈에 의하여 섬유소 단량체를 만들고 단량체가 서로 결합하여 중합체(polymer)가 되며, 이렇게 형성된 fibrin은 죽상동맥경화플라크를 더욱 크게 만들고 불안정화 시키는 역할을 할 수 있다. D-이합체는 일종의 섬유소분해산물로 혈액응고의 교차결합 섬유소중합체가 여러 효소 작용으로 최종적으로 생성된 물질이다. 그러나 D-이합체는 통상적으로 두 개의 D 도메인과 한 개의 E 도메인이 결합된 형태로 존재한다. 즉 정상인의 혈장에는 E 도메인이 떨어져 나간 순수한 D-이합체는 혈액응고 기전이 활성화된 경우를 제외하고는 거의 나타나지 않는다. 그러므로 D-이합체의 혈중 농도는 혈전증을 진단하는데 도움이 된다.

실험재료
필요장비 및 소모품

ELISA plate reader, pipette, pipette tip, plastic tube, orbital shaker 

 
필요시약

Asserachrom D-Di(Enzyme Immunoassay of D-Dimer) assay kit

Reagent 1 : mouse monoclonal anti-human D-dimer F(ab`)2 antibody가 coating되어 있는 strip

Reagent 2 : specific rabbit anti-human fragment D antibodies coupled with peroxidase

Reagent 3 : tetramethylbenzidine(<1%) solution

Reagent 4 : phosphate buffer

Reagent 5 : 20X washing solution

Reagent 6 : D-Di calibration

Reagent 7 : D-Di Control 1

Plate Frame, Plate Cover, 1M sulfuric acid

 
세포주

Mouse

 
실험방법

1. Kit의 설명서에 적힌 대로 reagent 1~7과 calibration 용액을 준비한다.

2. Plasma sample을 희석하여 준비한다. 

3. Quality control을 준비한다

4. Kit에서 지시하는 방법에 의거하여 plasma 내의 실험을 수행한다. 자세한 방법은 다음과 같다.

1) Kit의 설명서에 적힌 대로 reagent 1, 4, 6, 7을 준비한다.

2) Reagent 4로 Reagent 6, 7과 샘플을 희석한다.

3) 혈장 샘플 200ul를 well에 넣는다.

4) 상온에서 1시간 동안 incubation한다.

5) 1시간 후 well의 내용물을 버린다.

6) Reagent 5 350ul로 5번 washing한다. 

7) Reagent 2 200ul를 각 well에 넣는다.

8) 상온에서 1시간 동안 incubation한다.

9) Reagent 5 350ul로 5번 washing한다.

10) Reagent 3 200ul를 각 well에 넣는다.

11) Standard curve의 색이 gradient하게 변할 때가지 기다렸다가(약 5분) 1M H2SO4 50ul를 각 well에 넣는다.

12) Plate를 10-15분 동안 shaking한다.

13) 450nm에서 흡광도를 측정한다.

결과해석

이 방법의 원리는 시약내의 specific monoclonal antibody와 반응시켜 검사하는 것으로 공유결합한  micro particle이 혈장 내의 D-dimer와 응집하여 혼탁도가 증가된다. 혼탁도의 증가는 light absorption의 증가를 나타내며 이것은 혈장내의 D-dimer의 양과 비례하게 된다. 즉 D-dimer의 양이 증가 할수록 혈액에 혈전이 많은 것임을 알 수 있다. 

참고문헌 1. Ammar KA, Shapiro M, DDealing with markedly elevated false positive d-dimer by sequential testing with two d-dimer assays, Pak J Med Sci. 24(2):321-323, 2008
2. Mnonopi N, Levendal RA, Davies-Coleman MT, Frost CL, The cardioprotective effects of marrubiin, a diterpenoid found in Leonotis leonurus extracts, J Ethnopharmacol. 138(1):67-75, 2011
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실험재료
필요장비 및 소모품

ELISA plate reader, pipette(Thermo scientific), pipette tip(QSP), plastic tube(BD falcon), orbital shaker 

 
필요시약

Asserachrom D-Di(Enzyme Immunoassay of D-Dimer) assay kit(Bio-Medicine), Reagent 1 : mouse monoclonal anti-human D-dimer F(ab`)2 antibody가 coating되어 있는 strip

Reagent 2 : specific rabbit anti-human fragment D antibodies coupled with peroxidase

Reagent 3 : tetramethylbenzidine(<1%) solution

Reagent 4 : phosphate buffer

Reagent 5 : 20X washing solution

Reagent 6 : D-Di calibration

Reagent 7 : D-Di Control 1

Plate Frame, Plate Cover, 1M sulfuric acid

 
실험방법

1. Reagent 1을 개봉하기 전에 상온(18-25OC)에 30분간 두고 실험을 시작하기 직전에 파우치에서 꺼낸다.

2. Reagent 2(3개) 각 vial은 Reagent 4의 8ml로 희석한 후 상온(18-25℃)에 30분간 둔다. 

Tips:

-  사용하기 전에 반드시 vortex한다. 용액은 희석한 후 20±5℃에서 4시간 동안 안정하다.

3. Reagent 3 역시 상온(18-25℃)에 30분간 두고 즉시 사용한다.

4. Reagent 4 역시 사용하기 전 상온(18-25℃)에 30분간 둔다.

Tips:

- 오염되지 않는다면 2-8℃에서 15일간 안정하다.

5. Reagent 5(50ml)는 사용하기 전에 증류수(950ml)와 1:20의 비율로 희석한다.

Tips:

- 희석할 때의 final volume이 1000ml이 되도록한다.

- 2 strips(32 wells)를 실험하려면 Reagent 5의 15ml에 증류수 285ml을 넣어 final volume이 300ml이 되도록 한다. 

- 용액은 오염되지 않는다면 2-8℃에서 15일간 안정하다. 결정이 생겨도 reagent의 quality에 영향을 미치지 않지만 필요하다면 결정이 녹을 때까지 37℃에 둔다.

6. Reagent 6, Reagent 7은  0.5ml의 증류수에 녹인 후 상온(18-25℃)에 30분간 두고 vortex하여 사용한다.

- 용액은 희석한 후 20±5℃에서 4시간 동안 안정하다.

7. Calibration : Epen tube에 Reagent 6 (980 ng/ml) 50㎕와 Reagent 4 1ml을 섞어준다(즉 Reagent 6을 1:21의 비율로 희석함). 이렇게 희석한 starting solution을 절반씩 다섯 번 serial dilution한다.

8. Plasma sample 준비 : plasma sample은 2가지로 희석한다.

1) 1:21 (plasma 50ul + Reagent 4의 1ml)

2) 1:42 

9. Quality control : Reagent 7도 2가지로 희석한다.

1) 1:21 (Reagent 7의 50ul + Reagent 4의 1ml)

2) 1:42

10. Assay

1) Reagent 1, 4과 Reagent 6, 7을 동시에 꺼낸 후 Reagent 1, 4은 상온(18-25℃)에 두고 Reagent 6, 7은 0.5ml 증류수에 녹인 후 상온(18-25℃)에 30분간 두고 vortex하여 사용한다.

2) 30분 후 Reagent 4로 Reagent 6, 7과 샘플을 희석한다.

3) Assay를 시작하기 직전 파우치에서 strips를 꺼낸다.

4) 모든 샘플(calibrator, control, plasma)은 duplicate한다.

Tips:

- 샘플은 준비하고 난 2시간 내에 well에 pipetting한다. 모든 샘플은 well에 10분 내에 pipetting한다.

5) 96well plate의 A1, A2는 blank로 Reagent 4 200ul를 각각 넣는다.

6) B1, B2부터 A3, A4까지 7.에서 만든 standard solution을 200ul씩 넣는다.(낮은 농도에서 높은 농도 순으로)

7) B3, B4에는 control 200ul를 각각 넣는다.

8) 나머지 정해진 well에 샘플 200ul를 각각 넣는다.

9) Well을 덮고 1시간 동안 상온(18-25℃)에서 incubation한다.

10) Incubation 후 30분이 지났을 때 Reagent 2, 5를 꺼내고 Reagent 5를 희석한다. 

11) 1시간 후 well의 내용물을 버린다.

12) 희석한 Reagent 5의 350ul를 넣은 후 다시 buffer를 버리고 뒤집어서 plate를 말린다. 5번 반복한다.

Tips:

- Washing 과정 동안 well이 마른 상태로 있으면 안되므로 신속하게 washing작업을 한다.

13) Reagent 2를 각 well에 200ul 로딩한다.

14) Well을 덮고 1시간 동안 상온(18-25℃)에서 incubation한다.

15) Incubation 후 30분이 지났을 때 Reagent 3(TMB)를 꺼내놓는다.

16) 희석한 Reagent 5 350ul를 넣은 후 다시 buffer를 버리고 뒤집어서 plate를 말린다. 5번 반복한다.

17) Reagent 3(TMB)를 각 well에 200ul 넣는다.

Tips:

- 이 과정에서는 차광하는 것이 좋다. 

18) Standard curve의 색이 gradient하게 변할 때가지 기다렸다가(약 5분) 1M H2SO4 50ul를 각 well에 넣는다.

19) 각 well에 다 넣은 후 plate를 10-15분 동안 shaking한다.

20) 1시간 내에 450nm에서 흡광도를 측정한다.

실험결과 예


출처: Ammar KA et al., 2011 

결과해석

대조군(C)에 비해 시험물질군 (ASP, M)에서 유의적으로 D-dimer의 형성이 낮음을 확인하였고, 이로써 실험물질군이 혈전용해효과가 있는 것으로 나타났다. 

참고문헌 1. Ammar KA, Shapiro M, DDealing with markedly elevated false positive d-dimer by sequential testing with two d-dimer assays, Pak J Med Sci 2008;24(2):321-323
2. Mnonopi N, Levendal RA, Davies-Coleman MT, Frost CL, The cardioprotective effects of marrubiin, a diterpenoid found in Leonotis leonurus extracts, J Ethnopharmacol. 138(1):67-75, 2011
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