필요장비 및 소모품

도립현미경(Olympus), 무균작업대(수공테크), 항온수조(대일화학), 원심분리기(Sorvall fresco), 액체질소탱크(Cryogenics), Cryotube(Nunc), 배양 플라스크(T25/T75, SPL), 세포배양기(Thermo scientific), 1회용 pipette(10 ml, BD falcon), pipette(Thermo scientific), pipette tip(QSP), cell counter(Invitrogen)

 

필요시약

DMEM(Gibco), fetal bovine serum(Gibco), tryphan blue(Gibco), penicillin/streptomycin(Gibco), 0.5% Trypsin-EDTA(Gibco), PBS(Sigma)

 

1. 배지 제조

10% FBS/DMEM

2. 동결세포 해동 및 배양

1) 액체질소 탱크에 보관된 SK-N-SH 세포를 꺼내어, 곧바로 37℃ 항온수조기에 넣고 녹인다.

Tips: 

- 항온수조기의 온도를 미리 37℃로 셋팅한다. 

- 배지도 미리 데워둔다.

2) Vial속 배지가 거의 녹았을 때, 항온수조기에서 꺼내어 70% 에탄올로 소독하고 무균작업대로 신속하게 옮긴다. 

3) 배지에 세포를 풀고, 1000 rpm에서 3분간 원심분리한다.

4) 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 다시 배지를 넣어 single cell로 만든다.

5) 배지 5 ml를 넣은 배양 플라스크(T25)에 세포현탁액을 넣은 다음, 세포가 고르게 퍼질 수 있도록 잘 섞어준다.

6) 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 배양한다.

7) SK-N-SH 세포가 배양 플라스크 면적의 70~80%정도 차지하면 계대배양한다. 

8) 먼저, 배지를 버리고 PBS로 washing한다. 

9) PBS를 버리고 0.05% trypsin-EDTA 1ml를 처리하여 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 3분간 방치한다.

10) 세포가 잘 떨어졌는지 확인하고 미리 데워둔 배지를 첨가한다.

Tips: 

- FBS가 들어있는 배지를 처리하는 것은 trypsin 반응을 중지시키기 위함이다.

11) 세포현탁액을 tube에 모아 1000 rpm에서 3분간 원심분리한다.

12) 원심분리 후에, 상층액을 제거하고 배지를 넣어 세포를 풀어준다.

13) 배지 10 ml를 넣은 배양 플라스크(T75)에 세포현탁액을 넣고, 세포가 고르게 퍼질 수 있도록 섞어준다.

14) 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 배양한다.