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인지능력개선

시험관내 및 세포실험법

제목 대뇌 일차신경세포 배양
구분 인지능력향상 링크 기초실험법
실험배경

Cortex는 기억력에 관여하는 뇌 부위로, cortex에서 분리한  primary neuron은 시험물질의 효능을 평가하기 위한 세포 모델로 사용할 수 있다. 

실험재료
필요장비 및 소모품

도립현미경(Inverted microscope), 무균작업대(Clean bench), 항온수조(Water bath), 원심분리기, 액체질소탱크, Cryotube, 배양 플라스크(T25/T75), 세포배양기(CO2 incubator), 1회용 pipette (10 ml), pipette, pipette tip, cell counter

 
필요시약

Neurobasal media, B-27, L-glutamate, penicillin/streptomycin, Phosphate buffered saline(PBS), Hank`s balanced salt solution (HBSS), 0.5% trypsin-EDTA

 
세포주

마우스 primary neuron

 
실험방법

1. ICR mouse 임신 쥐(태아 15~16일 경)를 안락사 시킨 후에 탯줄을 잘라 태아를 확보한다.

2. 확보한 태아를 HBSS 용액에 담가서 clean bench로 이동시킨다.

3. Clean bench에서 태아를 개체별로 분리한 뒤 고정시킨다.

4. 고정시킨 후 각 마리당 cortex 부위 오른쪽, 왼쪽 부분을 채취해서 4 mL의 HBSS가 들어있는 15 mL tube에 넣는다.

5. 모든 태아에서 cortex의 채취가 끝나면 pipeting시킨 후에 원심분리기에 300g 속도로 2 min 돌린다.

6. 원심분리기로 돌린 후 trypsin이 첨가된 HBSS 배지를 넣은 후 shaking water bath에서 8~9 min 정도 놓는다.

7. shaking이 끝나면, 다시 원심분리기에 300g의 속도에 2 min간 돌린 후 상층액을 suction한다.

8. 다시 HBSS를 넣어준 후에 300g의 속도에 2 min간 돌린 후 상층액을 suction한다.

9. 8.의 과정을 2번 더 반복한다.

10. suction이 된 tube에 neurobasal media를 첨가시킨 후, 300g의 속도에 2 min간 돌린다.

11. suction하여 상층액을 제거한 후에 neurobasal media를 첨가 후 pipeting하여 조직을 흩뜨린다.

12. 흩뜨린 조직을 40 uM의 필터에 걸러 50 mL tube에 담은 후 세포의 양을 계측한다.

13. 계측한 세포를 원하는 수에 맞추어 계산한 후 적절한 비율로 배양액과 혼합하여 dish에 배양한다.

14. 배양기에 넣은 후 약 45분 후에 Neurobasal media로 배양액을 갈아준다.

15. 배양기에 넣고 약 3~4일 후에 분화가 되었는지 확인한다.

결과해석

세포가 dish에 부착되어 시간이 지남에 따라 수상돌기, 축색돌기 등이 자라나는 것을 확인할 수 있다. 

참고문헌 1. Tao Liu, Hui jin, Qin-Ru Sun, Jie-Hua Xu, Hai-Tao Hu, The neuroprotective effects of tanshinone IIA on β-amyloid-induced toxicity in rat cortical neurons, Neuropharmacology 59(7-8) p595-604, 2010
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제목 대뇌 일차신경세포 배양 링크 기초실험법
실험재료
필요장비 및 소모품

도립현미경 (Inverted microscope) (범용), 배양기 (범용), 무균작업대 (범용), 항온수조기(범용), 원심분리기 (범용), Deep freezer (범용), 질소탱크 (범용), Cryo 1℃ Freezing container (NALGENE), 10 cm 배양접시 (SPL), T25 flask (SPL), Cryotube (NUNC), Paraffin(alibaba), Niddle ((주)한국백신), plate reader(molecular devices)

 
필요시약

Neurobasal media (Gibco), B-27 (Gibco), L-glutamine (Gibco), Penicillin/streptomycin (Gibco), 0.5% Trypsin-EDTA (Gibco), Phosphate buffer saline (PBS) (바이오세상), Hank`s balanced salt solution (HBSS) (Gibco), Poly-d-lysine (Gibco), MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide)(usb), dimethylsulfoxide[DMSO](JUNSEI), hydrogenperoxide(JUNSEI)

 
실험방법

1. 실험 전 준비사항 

1) 배양용 배지 : Neurobasal 배지 482.5 mL에 B27 10mL, L-glumatmine 5 mL, Antibiotic(Strep./Peni.) 5 mL을 맞게 첨가해준 후 잘 흔들어준 후 24시간 정치 후 사용한다.

2) Paraffin plate : 고체 paraffin을 50℃ 이상의 고온에 녹여 액화시킨 후에 10 cm Dish의 반쯤 높이까지 오도록 부어서 paraffin plate를 만들어 태아를 고정시킬 수 있도록 한다.

3) Poly-D-lysin coating : Poly-D-lysine 20 mg/ml을 가지고 3차 멸균수로 희석하여 0.2 mg/ml을 만든 후에cell을 배양할 dish에 반쯤 높이까지 오도록 부어서 37℃ incubator에 overnight 시킨 후 일차신경세포 배양 전에PBS로 dish를 2번 washing 해준 후 HBSS 배지로 1번 washing하고 다시 37℃ incubator에 넣어준다(최소 일차신경세포 배양 4시간 전에 washing).

 

2. Primary neuronal cell 배양에 필요한 태아의 cortex 채취 및 신경세포 배양

1) ICR mouse 임신 쥐(태아 15~16일 경)를 안락사 시킨 후에 탯줄을 잘라 태아를 확보한다.

2) 확보한 태아를 10 cm Dish에 반쯤 차있는 cold HBSS 용액에 담가서 clean bench로 조심히 이동시킨다.

3) 태반과 섞여있는 부분을 가위와 포셉으로 제거한 후에 태아만 골라내어 kim wipes위에 놓아 수분을 제거한다.

4) 태아를 개체별로 분리한 뒤 paraffin plate에서 niddle을 이용해 태아의 목부분을 고정시켜 두개골을 절개하기 쉬운 상태로 만든다.

5) 고정시킨 태아의 뇌 부분 중 Cortex 부분만 채취가 가능하도록 소뇌가 존재하는 부분에서 수평방향으로 뇌를 절개하고, 다시 절개한 가운데 부위에서 얼굴방향으로 수직방향으로 뇌를 절개한다.

6) 절개한 후에 포셉을 이용하여 두개골 층을 벗겨낸 후에 포셉을 이용하여 Cortex 부위만 선택적으로 채취한다.

7) 채취한 cortex조직은 HBSS 4 mL이 들어있는 15 mL tube에 넣은 후에 잘 섞일 수 있도록 inverting해준다.

8) 3)~8)의 과정을 태아의 수만큼 반복해준다.

9) 모든 태아에서 cortex의 채취가 끝나면 pipeting시킨 후에 원심분리기에 300g 속도로 2 min 돌린다.

10) 원심분리기로 돌린 후 상층액을 suction한 후에 trypsin이 첨가된 HBSS 배지 10 mL을 넣은 후 37℃의shaking water bath에서 8~9 min 정도 놓는다.

11) shaking이 끝나면, 다시 원심분리기에 300g의 속도에 2 min간 돌린 후 상층액을 suction한다.

12) 다시 HBSS를 넣어준 후에 300g의 속도에 2 min간 돌린 후 상층액을 suction한다.

13) 12)의 과정을 2번 더 반복한다.

14) suction이 된 tube에 neurobasal media를 10ml 첨가시킨 후, 300g의 속도에 2 min간 돌린다.

15) suction하여 상층액을 제거한 후에 미리 37℃ water bath에서 데워진 neurobasal media를 첨가 후 15번 이상 pipeting하여 조직을 흩뜨린다.

16) 흩뜨린 조직을 40 uM 직경의 필터에 걸러 50 mL tube에 담은 후 hematocytometer을 이용해 세포의 양을 계측한다.

17) 계측한 세포를 원하는 수에 맞추어 계산한 후 적절한 비율로 배양액과 혼합하여 dish에 배양한다.

18) dish를 37℃의 incubator에 넣은 후 약 45분 후에 미리 37℃ water bath에서 데워진 Neurobasal media로 배양액을 갈아준다.

19) dish를 37℃의 incubator에 넣은 후 약 3-4일 후에 분화가 되었는지 확인한다.

실험결과 예

출처 : Tao Liu et al., 2010 

결과해석

 

참고문헌 1.Tao Liu, Hui jin, Qin-Ru Sun, Jie-Hua Xu, Hai-Tao Hu, The neuroprotective effects of tanshinone IIA on β-amyloid-induced toxicity in rat cortical neurons, Neuropharmacology 59(7-8) p595-604, 2010
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