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인지능력개선

시험관내 및 세포실험법

제목 β-secretase 활성 측정
구분 인지능력향상 링크 β-secretase 활성 측정
실험배경

β-secretase(BACE1)는 아밀로이드 전구 단백질(amyloid precursor protein, APP)에 특이적으로 반응하는 효소로 APP 아미노산 말단을 절단하여 Aβ 생성에 관여하며, 최근 알츠하이머 질환 치료제로 많이 연구되고 있다. 따라서, 기능성 소재의 효능을 확인하기 위한 스크리닝 방법으로도 사용되고 있으며, 동물모델 인지능력개선 효능을 평가하기 위한 하나의 바이오마커로 활용될 수 있다.

실험재료
필요장비 및 소모품

형광분광계, black 96-microwell plates, pipette, pipette tip, multipipette

 
필요시약

β-secretase assay kit

 
세포주

 

 
실험방법

1. 실험에 필요한 시약과 용매를 준비한다. 

2. Black 96-microwell plate에  reaction buffer 10 μl, BACE1 substrate 10 μl,  β-secretase 효소(1 units/ml), 시험물질 10 μl를 넣는다.

3. 1시간 동안 반응시킨다. 

4. Stop solution 10 μl를 가하여 반응을 정지시킨다. 

5. Ex 545/Em 585 nm 파장으로 형광강도를 측정한다.

결과해석

시험물질에 의한 β-secretase 활성 감소는 β-amyloid 형성에 영향을 미칠 수 있을 것으로 판단된다. 

참고문헌 1. Vassar R, Bennett BD, Babu-Khan S, Kahn S, Mendiaz EA, Denis P, Teplow DB, Ross S, Amarante P, Loeloff R, Luo Y, Fisher S, Fuller J, Edenson S, Lile J, Jarosinski MA, Biere AL, Curran E, Burgess T, Louis JC, Collins F, Treanor J, Rogers G, Citron M. β-Secretase cleavage of Alzheimer`s amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE. Science 286:735-741, 1999
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제목 β-secretase 활성 측정 링크 β-secretase 활성 측정
실험재료
필요장비 및 소모품

형광분광계(TECAN), black 96-microwell plates(Falcon), pipette(eppendorf), pipette tip(QSP), multipipette(eppendorf)

 
필요시약

β-secretase assay kit(Panvera)

 
실험방법

1. 실험에 필요한 시약과 용매를 준비한다. 

1) BACE assay buffer(50 mM sodium acetate, pH 4.5)

2) BACE1 enzyme(1 unit/ml)

3) BACE1 substrate(750 nM Rh-EVNLDAEFK-quencher):  40 μl + 3960 μl BACE1 assay buffer, 제조 후 24시간 내에 사용

4) Stop solution(2.5 M sodium acetate)

2. Black 96-microwell plate에  assay buffer 10 μl, BACE1 substrate 10 μl,  β-secretase 효소(1 units/ml), 시험물질 10 μl를 넣는다.

Tips: 시험물질은 농도별로 만들어 사용한다. 이때 assay buffer를 사용한다.

3. RT, 1시간 동안 반응시킨다.

Tips: 빛을 차단시키기 위해 호일로 싼다.

4. Stop solution 10 μl를 가하여 반응을 정지시킨다.

5. Ex 545/Em 585 nm 파장으로 형광강도를 측정한다.

6. 아래의 공식으로 계산한다.

*계산법

Inhibition(%)=[1-{(S-S0)/(C-C0)}X100

C=control, S=sample

실험결과 예

출처: Son HJ et al., 2016

결과해석

시험물질에 의한 β-secretase 활성이 감소하여, 인지기능개선 효과를 간접적으로 확인할 수 있다. 

참고문헌 1. 손현정, 엄민영, 김인호, 조승목, 한대석, 이창호. 해조류 추출물의 In Vitro 항치매 활성. 한국식품영양과학회지 45(7):966-975, 2016
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