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인지능력개선

시험관내 및 세포실험법

제목 SK-N-SH 세포에서 세포생존율 측정(MTT assay)
구분 인지능력향상 링크 신경세포사멸
실험배경

신경세포사멸의 원인인 산화스트레스 또는 독성물질(β-amyloid, TNF-α 등) 등을 처리하고, 동시에 후보소재를 처리하여 세포생존율을 평가함으로써 in vitro 후보소재의 뇌세포 보호 효과에 대한 평가가 가능하다. 세포 생존률은 황색수용물질인 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)가 미토콘드리아 내의 탈수소효소 작용(mitochondrial dehydrogenas)에 의하여 yellow에서 dark blue formazan로 환원되는 원리를 이용하는 것으로, 그 환원되는 정도를 측정하는 MTT assay 방법을 이용한다.

실험재료
필요장비 및 소모품

도립현미경, 무균작업대, 항온수조, 원심분리기, 배양플라스크, 세포배양기, 1회용 pipette, pipette, pipette tip, cell counter, 96 well plate, 15 ml tube 

 
필요시약

Dulbecco`s Modified Eagles Medium(DMEM), fetal bovine serum, insulin, sodium pyruvate, tryphan blue, penicillin/streptomycin, 0.5% trypsin-EDTA, phosphate buffered saline(PBS), Dimethyl sulfoxide (DMSO), MTT, β-amyloid

 
세포주

SK-N-SH cell

 
실험방법

1. 96 well plate에 세포배양방식과 동일한 방법으로 세포를 배양한다.

2. 배양 된 세포에 β-amyloid를 처리한다.

3. 24시간동안 incubation한다.

4. 24시간 후에 MTT의 최종 농도가 0.5 mg/ml이 되도록 MTT solution을 배지에 처리한다.

5. 4시간동안 incubation시킨다.

6. 밑에 남아있는 침전물을 제외한 나머지 배지를 suction한다.

7. DMSO를 첨가한 뒤, 30분정도 shaker에 놓아둔다.

8. 540 nm의 파장에서 흡광도를 측정한다.

결과해석

대조군과 후보소재의 세포생존율을 비교하여, 생존율이 높으면 신경세포보호효과를 확인할 수 있다. 

참고문헌 1. Um MY, Ahn JY, Kim MK, Ha TY. Sesaminol glucosides protect β-amyloid induced apoptotic cell death by regulating redox system in SK-N-SH cells. Neurochem Res. 37(4):689-69, 2012
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제목 SK-N-SH 세포배양 링크 신경세포사멸
실험재료
필요장비 및 소모품

도립현미경(Olympus), 무균작업대(수공테크), 항온수조(대일화학), 원심분리기(Sorvall fresco), 배양 플라스크(T25/T75, SPL), 세포배양기(Thermo scientific), 1회용 pipette(10 ml, BD falcon), pipette(Thermo scientific), pipette tip(QSP), cell counter(Invitrogen), 96 well plate(Falcon), 15 ml tube(Flacon)

 
필요시약

DMEM(Gibco), fetal bovine serum(Gibco), tryphan blue(Gibco), penicillin/streptomycin(Gibco), 0.5% Trypsin-EDTA(Gibco), PBS(Sigma), DMSO(Sigma), MTT(Sigma), β-amyloid(Sigma)

 
실험방법

1. 96 well plate에 세포배양 방식과 동일한 방법으로 200 ul의 세포배양액을 첨가한 후에 5% CO2, 37도에 24시간 incubation시킨다.

2. β-amyloid 및 시험물질을 농도별로 처리한다.

3. 24시간 동안 5% CO2, 37℃에서 배양한다.

4. incubation 후에 MTT의 최종 농도가 0.5 mg/ml이 되도록 MTT solution을 배지에 처리한다.

5. 호일 등에 싸서 빛을 차광한 뒤에 5% CO2, 37 온도에 incubation 시킨다.

6. clean bench안에서 96 well plate 밑에 남아있는 침전물을 제외한 나머지 배지부분을 suction한다.

7. DMSO 150 μl를 각 well에 첨가한 후 20-30분 정도 shaker에 놓아둔다.

8. 540 nm에서 흡광도를 측정한다.

9. 대조군을 기준으로 하여 계산한다. 

실험결과 예

출처: Um MY et al., 2012

결과해석

세포생존율이 높을수록 MTT formazan이 많이 생성된다. 대조군과 비교하여 후보소재를 처리한 군에서 MTT formazan 생성이 높을수록 신경세포가 사멸하지 않았다는 것을 의미한다.

참고문헌 1. Um MY, Ahn JY, Kim MK, Ha TY. Sesaminol glucosides protect β-amyloid induced apoptotic cell death by regulating redox system in SK-N-SH cells. Neurochem Res. 37(4):689-69, 2012
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