필요장비 및 소모품

전기영동장치(Bio-Rad), transfer 장치(Bio-Rad), power supply(Bio-Rad), 유리판(Bio-Rad), comb(Bio-Rad), PVDF membrane(Milipore), 3MM filter paper(Bio-Rad), 원심분리기(Eppendorf), pipette(Eppendorf), pipette(Eppendorf), ELISA reader(TECAN), 조직 균질기(MP biomedicals), test tube(SARSTEDT), 96 well plate(BD falcon), Rotary shaker(OP-100), 핀셋, 플라스틱통, 이미지장비(Bio-Rad)

 

필요시약

Prep solution (protein extraction solution, iNtron), Tris(Sigma), glycerol(Sigma), SDS(Sigma), bromophenol blue(Sigma), 2-mercaptoethanol(Sigma), acrylamide mix(Sigma), ammonium persulfate(Sigma), TEMED(Sigma), glycine(Sigma), Coomassie gel stain solution(Sigma), methanol(Sigma), buthanol(amresco), Ponceau S solution(Sigma), skim milk(Gibco), bovine serum albumin(AMRESCO), NaCl(Sigma), Tween 20(Sigma), pirmary antibody(caspase-3, -9/cleaved caspase-3, -9, Cell signaliing), Antirabbit IgG secondary antibody(Cell Signaling), WEST-one(ECL solution, iNTRON), TBS(또는 PBS, Sigma), bradford solution(BioRad)

 

1. 세포에서 단백질을 추출하고, Bradford assay를 이용하여 정량한다. 

2. 단백질 농도를 30 μg으로 맞추어 시료를 준비한다.

Tips: 단백질 농도는 실험조건에 맞게 조정할 수 있다.

3. Gel unit을 장치한다.

4. 10% acrylamide separating gel solution(D.W. 4.3 ml, 40% acrylamide mix 3 ml, 1.5 M Tris(pH8.8) 2.5 ml, 

10% SDS 100μl, 10% APS 100 μl, TEMED 4 μl; total volume 10 ml)을 준비한다. 

Tips: 단백질 분자량에 맞추어 acrylamide %를 조정할 수 있다. 

5. 준비한 separating solution을 유리판 사이에 주입한다.

6. Water-saturated n-butanol을 조심스럽게 seperating gel 위에 뿌리고, 약 20~30분간 방치하여 gel을 굳힌다.

Tips:

- Water-saturated n-butanol: 물과 butanol을 1:1로 섞은 후, 아래층을 버린다. 이 과정을 반복한다. 

- Water-saturated n-butanol은 seperating gel 경계면을 평평하게 만들기 위함이다.

7. Water-saturated n-butanol을 버리고 D.W로 여러 번 씻어준다. 물기는 3MM paper를 사용하여 제거한다.

8. 5% stacking gel solution (D.W. 3.6075 ml, 40% acrylamide mix 622.5 μl, 1.5 M Tris(pH6.8) 630 μl, 

10% SDS 50 μl, 10% APS 50 μl, TEMED 5 μl; total volume 5 ml)을 준비하여 seperating gel 위에 붓고, comb를 꽂는다. 약 10~20분간 방치하여 응고시킨다.

9. Gel이 응고되면 comb를 조심스럽게 제거하고 주변 장치도 제거한다. Well 사이를 물로 씻어내고, 유리판에 묻은 gel도 제거해준다.

10. Gel이 굳어있는 유리판을 전기영동장치에 고정시킨다.

11. 유리판과 전기영동장치 사이에 running buffer를 가득 채우고, tank에도 buffer를 넣어서 백금선이 닿도록 한다.

Tips: running buffer-0.025 M Tris, 0.192 M glycine, 1% SDS 

12. 각 well에 정량한 단백질과 marker를 loading한다.

13. 전기영동 한다(100 volt, 90분).

14. 전기영동이 끝난 후, gel을 장치와 유리판에서 조심스럽게 분리하여 transfer buffer에 침지시킨다.

Tips: transbuffer-0.025 M Tris, 0.192 M glycine, 20% methanol

15. Gel를 membrane 위에 얹고 다음과 같이 장치한 후, transfer buffer를 transfer kit에 채운다. 

Tips: 

- Membrane은 메탄올에 미리 적셔 activation 시킨다.

- Fiber pad, filter paper는 transfer buffer에 미리 담근다. 

16. Tank에 transfer buffer를 채운 뒤, 350 mA, 2시간 정도 transfer한다. 

Tips: 

- 온도가 올라가면 gel sandwich사이에 공기방울이 형성되어 transfer가 잘 되지 않으므로 아이스팩을 사용하여 냉각시켜 준다. 

- 단백질이 제대로 transfer 되었는지 확인하기 위해, Ponceau S 용액에 2분 정도 담가두어서 붉게 염색 된 band를 확인한다. DW로 헹구어 주면 Ponceau S staining은 제거된다.

17. Transfer가 끝난 뒤 Membrane을 실온에서 2시간동안 5% skim milk/TBST로 Blocking한다. 

Tips: 

- skim milk대신 bovine serum albumin(BSA)를 이용하기도 한다. 

- TBST: 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.4

18. 상온에서 TBST로 15분, 5분, 5분간 shaking하면서 washing한다.

19. Primary antibody(caspase-3, -9/cleaved caspase-3, -9)을 TBST로 1,000배 희석한 용액에 membrane에 넣고 4℃에서 shaking하면서 overnight한다.

Tips: 

- Primary antibody의 사용량은 실험적으로 결정되기 때문에, 권장사용량에 맞추어 사용하면 된다. 

- 상온에서 2~4시간 shaking할 수 있다.

20. TBST로 15분, 5분, 5분씩 shaking하여 washing한다.

21. Secondary antibody을 TBST로 10,000배 희석한 용액에 membrane에 넣고 상온에서 2시간동안 shaking한다.

22. TBST로 15분, 5분, 5분씩 shaking하여 washing한다.

23. 이미지 장비를 이용하여, band를 확인하다.

출처: Kim J et al., 2012

신경세포에 H2O2 처리한 결과, cleaved caspase-3 단백질 발현이 증가된 반면, 시험물질을 처리한 군에서는 감소하여 세포사멸에 영향을 미칠 것으로 판단된다.