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인지능력개선

시험관내 및 세포실험법

제목 NF-kB 단백질 발현량 측정
구분 인지능력향상 링크 신경염증
실험배경

Nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAID)를 복용한 경험이 있는 사람들에서 알츠하이머 질환 risk가 감소한다는 임상연구가 있으며, 노인의 인지기능 결손과 염증은 상관관계가 있는 것으로 보고되고 있다. NF-kB는 염증반응을 조절하는 중요한 신호전달 물질이다. Cytokine 등의 다양한 자극에 의해 IkB 단백질이 인산화되어 분해되면, 유리된 NF-kB는 핵 내로 들어가서, target 유전자의 NF-kB binding site에 결합하여 염증 관련 유전자 (COX-2 등)의 발현을 유도한다. 따라서, 기능성 소재의 인지능력 개선 효능을 평가하기 위한 하나의 바이오마커로 활용할 수 있다.

실험재료
필요장비 및 소모품

전기영동장치, transfer 장치, power supply, glass plate, comb, spacer, membrane(PVDF 또는 nitrocellulose), 원심분리기, pipette, pipette tip, rotary shaker, fiber pad, test tube, 3MM paper, 핀셋, ELISA reader, 96-well plate, 플라스틱통, 이미지장비

 
필요시약

전기영동장치, transfer 장치, power supply, glass plate, comb, spacer, membrane(PVDF 또는 nitrocellulose), 원심분리기, pipette, pipette tip, rotary shaker, fiber pad, test tube, 3MM paper, 핀셋, ELISA reader, 96-well plate, 플라스틱통, 이미지장비

 
세포주

PC-12, primary cortical neuron 등

 
실험방법

1. 세포에 시험물질을 처리한 후, lysis하여 단백질을 추출하고 정량한다.  

2. 정량한 단백질 샘플을 SDS-acrylamide gel에 loading하고, 전기영동 한다. 

3. Membrane으로 transfer한다. 

4. Transfer한 membrane을 blocking buffer로 상온에서 1시간 동안 shaking한다. 

5. TBST(또는 PBST)로 10분 동안 washing(3회 반복).

6. Primary antibody(NF-kB, IkB, p65)를 넣고 상온(또는 4℃ overnight)에서 2시간 정도 shaking한다.

7. TBST(또는 PBST)로 10분 동안 washing(3회 반복).

8. Secondary antibody를 상온(또는 4℃ overnight)에서 1시간 정도 shaking한다.

9. TBST(또는 PBST)로 10분 동안 washing(3회 반복).

10. ECL solution를 membrane에 뿌리고, band를 확인한다.

결과해석

Western band의 density를 확인하여  NF-kB, IkB, p65 단백질 발현 정도를 확인할 수 있다. 후보 소재를 처리함으로써 NF-kB, IkB, p65 감소는 신경 염증반응을 저해할 것으로 판단된다. 

참고문헌 1. Schram MT, Euser SM, de Craen AJ, Witteman JC, Frölich M, Hofman A, Jolles J, Breteler MM, Westendorp RG. Systemic markers of inflammation and cognitive decline in old age. J Am Geriatr Soc. 55(5):708-716, 2007
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제목 NF-kB 단백질 발현량 측정 링크 신경염증
실험재료
필요장비 및 소모품

전기영동장치(Bio-Rad), transfer 장치(Bio-Rad), power supply(Bio-Rad), 유리판(Bio-Rad), comb(Bio-Rad), PVDF membrane(Milipore), 3MM filter paper(Bio-Rad), 원심분리기(Eppendorf), pipette(Eppendorf), pipette(Eppendorf), ELISA reader(TECAN), 조직 균질기(MP biomedicals), test tube(SARSTEDT), 96 well plate(BD falcon), Rotary shaker(OP-100), 핀셋, 플라스틱통, 이미지장비(Bio-Rad)

 
필요시약

Prep solution (protein extraction solution, iNtron), Tris(Sigma), glycerol(Sigma), SDS(Sigma), bromophenol blue(Sigma), 2-mercaptoethanol(Sigma), acrylamide mix(Sigma), ammonium persulfate(Sigma), TEMED(Sigma), glycine(Sigma), Coomassie gel stain solution(Sigma), methanol(Sigma), buthanol(amresco), Ponceau S solution(Sigma), skim milk(Gibco), bovine serum albumin(AMRESCO), NaCl(Sigma), Tween 20(Sigma), pirmary antibody(Bax, Bcl-2, Cell signaliing), Antirabbit IgG secondary antibody(Cell Signaling), WEST-one(ECL solution, iNTRON), TBS(또는 PBS, Sigma), bradford solution(BioRad)

 
실험방법

1. 세포에서 단백질을 추출하고, Bradford assay를 이용하여 정량한다. 

2. 단백질 농도를 30 μg으로 맞추어 시료를 준비한다.

Tips: 단백질 농도는 실험조건에 맞게 조정할 수 있다.

3. Gel unit을 장치한다.

4. 10% acrylamide separating gel solution(D.W. 4.3 ml, 40% acrylamide mix 3 ml, 1.5 M Tris(pH8.8) 2.5 ml, 10% SDS 100μl, 

10% APS 100 μl, TEMED 4 μl; total volume 10 ml)을 준비한다. 

Tips: 단백질 분자량에 맞추어 acrylamide %를 조정할 수 있다. 

5. 준비한 separating solution을 유리판 사이에 주입한다.

6. Water-saturated n-butanol을 조심스럽게 seperating gel 위에 뿌리고, 약 20~30분간 방치하여 gel을 굳힌다.

Tips:

- Water-saturated n-butanol: 물과 butanol을 1:1로 섞은 후, 아래층을 버린다. 이 과정을 반복한다. 

- Water-saturated n-butanol은 seperating gel 경계면을 평평하게 만들기 위함이다.

7. Water-saturated n-butanol을 버리고 D.W로 여러 번 씻어준다. 물기는 3MM paper를 사용하여 제거한다.

8. 5% stacking gel solution (D.W. 3.6075 ml, 40% acrylamide mix 622.5 μl, 1.5 M Tris(pH6.8) 630 μl, 10% SDS 50 μl, 

10% APS 50 μl, TEMED 5 μl; total volume 5 ml)을 준비하여 seperating gel 위에 붓고, comb를 꽂는다. 약 10~20분간 방치하여 응고시킨다.

9. Gel이 응고되면 comb를 조심스럽게 제거하고 주변 장치도 제거한다. Well 사이를 물로 씻어내고, 유리판에 묻은 gel도 제거해준다.

10. Gel이 굳어있는 유리판을 전기영동장치에 고정시킨다.

11. 유리판과 전기영동장치 사이에 running buffer를 가득 채우고, tank에도 buffer를 넣어서 백금선이 닿도록 한다.

Tips: 

- running buffer-0.025 M Tris, 0.192 M glycine, 1% SDS 

12. 각 well에 정량한 단백질과 marker를 loading한다.

13. 전기영동 한다(100 volt, 90분).

14. 전기영동이 끝난 후, gel을 장치와 유리판에서 조심스럽게 분리하여 transfer buffer에 침지시킨다.

Tips: transbuffer-0.025 M Tris, 0.192 M glycine, 20% methanol

15. Gel를 membrane 위에 얹고 다음과 같이 장치한 후, transfer buffer를 transfer kit에 채운다. 

Tips: 

- Membrane은 메탄올에 미리 적셔 activation 시킨다.

- Fiber pad, filter paper는 transfer buffer에 미리 담근다. 

16. Tank에 transfer buffer를 채운 뒤, 350 mA, 2시간 정도 transfer한다. 

Tips: 

- 온도가 올라가면 gel sandwich사이에 공기방울이 형성되어 transfer가 잘 되지 않으므로 아이스팩을 사용하여 냉각시켜 준다. 

- 단백질이 제대로 transfer 되었는지 확인하기 위해, Ponceau S 용액에 2분 정도 담가두어서 붉게 염색 된 band를 확인한다. DW로 헹구어 주면 Ponceau S staining은 제거된다.

17. Transfer가 끝난 뒤 Membrane을 실온에서 2시간동안 5% skim milk/TBST로 Blocking한다. 

Tips: 

- skim milk대신 bovine serum albumin(BSA)를 이용하기도 한다. 

- TBST: 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.4

18. 상온에서 TBST로 15분, 5분, 5분간 shaking하면서 washing한다.

19. Primary antibody(NF-kB, IkB, p65)을 TBST로 1,000배 희석한 용액에 membrane에 넣고 4℃에서 shaking하면서 overnight한다.

Tips: 

- Primary antibody의 사용량은 실험적으로 결정되기 때문에, 권장사용량에 맞추어 사용하면 된다. 

- 상온에서 2~4시간 shaking할 수 있다.

20. TBST로 15분, 5분, 5분씩 shaking하여 washing한다.

21. Secondary antibody을 TBST로 10,000배 희석한 용액에 membrane에 넣고 상온에서 2시간동안 shaking한다.

22. TBST로 15분, 5분, 5분씩 shaking하여 washing한다.

23. 이미지 장비를 이용하여, band를 확인하다.

실험결과 예


출처: Jang JH et al., 2003

결과해석

신경세포에 β-amyloid를 처리한 결과, cytoplasmic extract에서 IkB는 감소/nuclear extract에서 p65 증가한 반면, 후보물질에 의해 이와 반대의 결과가 관찰되어 염증반응에 영향을 미칠 것으로 판단된다.

참고문헌 1. Jang JH, Surh YJ. Protective effect of resveratrol on beta-amyloid-induced oxidative PC12 cell death. Free Radic Biol Med. 34(8):1100-1110, 2003
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