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인지능력개선

동물실험법

제목 아세틸콜린 함량 측정
구분 인지능력향상 링크 신경전달물질 및 시냅스 가소성
실험배경

아세틸콜린(acetylcholine)은 choline acyltransferase에 의해 뇌 신경세포에서 합성되고 시냅스 간극으로 방출되어, 신경세포 사이의 자극을 전달하는 흥분성 신경전달물질이다.  뇌 내에 아세틸콜린 부족은 인지능력 저하의 원인이 될 수 있으므로, 기능성 소재의 효능을 확인하기 위한 바이오마커로 활용할 수 있다. 
실험재료
필요장비 및 소모품

96 well plate , ELISA microplate reader, scissors, force, liquid NO2 0.5-1L, Spetula, deepfreezer, homogenizer, Vortex mixer, pipet , 1.5 ml tube, Incubator

 
필요시약

Acetylcholine assay kit, PBS, Tween 20

 
세포주

mouse, rat 등

 
실험방법

1. 실험에 필요한 시약 및 시험물질을 조제한다. 

2. 뇌 조직을 균질화 한다.

3. 96 well plate에 assay buffer  46 μl, choline probe 2 μl, acetylcholinesterase 2 μl, enzyme mix 2 ul를 넣고 혼합한다. 

4. 30분간 실온에서 반응시킨다. 

5. 570 nm에서 흡광도를 측정한다. 
결과해석

후보소재에 의한 아세틸콜린 농도 증가는 인지능력개선에 영향을 미칠 수 있다. 
참고문헌 1. Huang M, Kwon S, Oyamada Y, Rajagopal L, Miyauchi M, Meltzer HY. Dopamine D3 receptor antagonism contributes to blonanserin-induced cortical dopamine and acetylcholine efflux and cognitive improvement. Pharmacol Biochem Behav. 138:49-57, 2015
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제목 아세틸콜린 함량 측정 링크 신경전달물질 및 시냅스 가소성
실험재료
필요장비 및 소모품

저울(동서과학), 원심분리기(비전과학), 96 well plate (SPL) , ELISA microplate reader (Molecular devices), scissors(kent scientific), forcep (kent scientific), liquid NO2 0.5-1L (동아가스), Spetula(kent scientific), deepfreezer (대일테크), homogenizer (KINEMATICA) Vortex mixer (IKa works), pipet (1-10, 10-100, 100~1000 ㎕, Eppendorf), 1.5 ml tube (Oxygen), Incubator (대일테크)

 
필요시약

Acetylcholine assay kit (Sigma), PBS(바이오세상), Tween 20 (JUNSEI)

 
실험방법

1. 뇌 조직을 homogenizer를 이용하여 얼음위에서 균질화시킨다. 

2. 13,000 g, 4℃, 10분간 원심 분리한다.

3. 상층액을 새로운 ep tube에 옮긴 후, 실험에 사용한다. 

4. Acetylcholine assay kit에서 필요한 시약을 만든다.

1) Choline assay buffer

2) Choline probe: -20℃ 보관, 녹여서 바로 사용

3) Choline enzyme mix, Acetylcholinesterase

4) Choline standard (50 mM): 10배 희석하여 사용한다. 

5. 96 well plate에 시험용액을 넣는다.

- Free choline: assay buffer  46 μl, choline probe 2 μl, enzyme mix 2 ul 

- Total choline: assay buffer  44 μl, choline probe 2 μl, enzyme mix 2 ul, acetylcholinesterase 2 μl

4. 30분간 실온에서 반응시킨다. 

Tips: 빛을 차단한다.

5. 570 nm에서 흡광도를 측정하고 농도를 계산한다. 

 

*계산법: 

Acetylcholine (Sacetyl) = total choline (Stotal) ? free choline (Sfree)

Sacetyl/Sv = C

Sv = Sample volume (μL) added into the wells

C = Concentration of Acetylcholine in sample

Acetylcholine molecular weight: 146.2 g/mole
실험결과 예


출처: Sark HF et al., 2014
결과해석

대조군에 비해 시험물질 보충군에서 acetylcholine 함량이 증가하여 인지능력 개선 효과가 있을 것으로 판단할 수 있다. 
참고문헌 1. Sakr HF, Khalil KI, Hussein AM, Zaki MS, Eid RA, Alkhateeb M. Effect of dehydroepiandrosterone (DHEA) on memory and brain derived neurotrophic factor (BDNF) in a rat model of vascular dementia. J Physiol Pharmacol. 65(1):41-53, 2014
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