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인지능력개선

동물실험법

제목 Acetylcholinesterase 활성 측정
구분 인지능력향상 링크 신경전달물질 및 시냅스 가소성
실험배경

Acetylcholinesterase는 신경전달물질인 아세틸콜린(acetylcholine)를 아세틸과 콜린으로 가수분해하는 효소이다. 알츠하이머 환자의 뇌에는 아세틸콜린 함량이 정상인보다 낮은데, acetylcholinesterase 활성이 증가하면 아세틸콜린을 분해해 그 농도를 감소시키고, 일련의 반응을 통해 신경세포 손상을 초래하여 기억력 결핍을 유발하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 기능성 소재의 효능을 확인하기 위한 바이오마커로 활용할 수 있다. 

실험재료
필요장비 및 소모품

분광광도계, 일회용 cuvette, pipette, pipette tip, pH meter, 균질기용 튜브 및 봉(Teflon pestle), 원심분리기 등

 
필요시약

Monobasic phosphate, dibasic sodium phosphate, sodium bicarbonate, acetylcholinesterase, 5,5`-dithio-bis-2-nitrobenzoic acid(DTNB), acetylcholine iodide

 
세포주

 

 
실험방법

1. 뇌 조직 균질화시킨다. 

2. 균질액을 12,000 g, 4℃, 10분간 원심 분리한다.

3. 상층액을 새로운 튜브로 옮기고, 효소원으로 사용한다. 

4. Cuvette에 효소원 0.1 ml, phosphate buffer 2.9 ml, DTNB 용액 0.1 ml, acetylcholine iodide 10 μl를 넣고 잘 혼합한다. 

5. 분광광도계를 이용하여 412 nm에서 흡광도를 측정한다. 

결과해석

시험물질에 의한 acetylcholinesterase 활성 감소는 아세틸콜린 분해에 영향을 미칠 수 있을 것으로 판단된다. 

참고문헌 1. Talesa VN. Acetylcholinesterase in Alzheimer`s disease.
Mech Ageing Dev 122: 1961-1969, 2001
2. Ellman GL, Courtney KD, Andres V Jr, Feather-Stone RM. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase
activity. Biochem Pharmacol 7: 88-95, 1961
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제목 Acetylcholinesterase 활성 측정 링크 신경전달물질 및 시냅스 가소성
실험재료
필요장비 및 소모품

분광광도계(Jasco), 1회용 cuvette(애큐리서치코리아),  pipette(Thermo scientific), pipette tip(QSP), pH meter(METTLER TOLEDO), 균질기용 튜브 및 봉(Teflon pestle, Corning), 원심분리기(eppendorf) 등

 
필요시약

Monobasic phosphate(Sigma), dibasic sodium phosphate(Sigma), sodium bicarbonate(Sigma), acetylcholinesterase(Sigma),  5,5`-dithio-bis-2-nitrobenzoic acid(DTNB, Sigma), acetylcholine iodide(Sigma)

 
실험방법

1. 뇌 조직 효소원 준비

1) 적출한 뇌 조직 0.2g씩 취하고, PBS 2 ml을 넣어 조직 균질기로 균질화 한다.

2) 균질액을 EP tube로 옮기고, 10,000 g, 4℃, 10분간 원심 분리한다.

3) 원심분리 후, 상층액을 새로운 EP tube로 옮겨 효소원으로 사용한다.

Tips: 

- 효소원은 ?70℃에 넣고 보관한다. 

- 모든 과정은 ice 상태에서 진행한다.

 

2. Acetylcholinesterase 활성 측정

1) Cuvette에 효소원 0.1 ml, 0.1 M phosphate buffer(pH 8.0) 2.9 ml, 3 mM DTNB 용액 0.1 ml를 넣고 잘 혼합한다. 

2) 0.075M acetylcholine iodide 10 μl를 첨가한다. 

3) 412 nm에서 흡광도를 5분간 측정한다. 

4) 효소원을 20배 희석하여 단백질 농도를 측정한다. 

5) Bradford reagent를 D.W.로 5배 희석(bradford : D.W. = 1 : 4, v/v)하여 필요량만큼 준비한다.

6) BSA(1 mg/ml)를 농도별로 희석한다.

7) 96 well plate에 준비한 시료와 BSA를 10 μl 넣고, 희석한 bradford reagent를 190 μl를 넣는다.

8) ELISA reader를 이용하여 595 nm에서 측정한다.

실험결과 예


출처: Park SK et al., 2016

결과해석

대조군과 비교하여, 시험물질 보충군에서 acetylcholinesterase 활성이 감소하여 인지능력개선 효과를 확인할 수 있다.

참고문헌 1. Park SK, Ha JS, Kim JM, Kang JY, Lee du S, Guo TJ, Lee U, Kim DO, Heo HJ. Antiamnesic Effect of Broccoli (Brassica oleracea var. italica) Leaves on Amyloid Beta (Aβ)1-42-Induced Learning and Memory Impairment. J Agric Food Chem. 64(17):3353-3361, 2016
2. Ellman GL, Courtney KD, Andres V Jr, Feather-Stone RM. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase
activity. Biochem Pharmacol 7: 88-95, 1961
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