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혈행개선

동물실험법

제목 Spontaneously hypertensive rat (SHR) 동물모델
구분 혈행개선 링크 동물모델
실험배경

오카모토 등에 의해 Wistar-Kyoto 계 래트 콜로니에서 매 세대 고혈압을 지표로 하여 선발. 교배를 반복한 동물로서 1963년에 확립되었다. 7~15 주령으로 100%의 개체가 고혈압을 자연 발병한다. 혈압은 10주령으로 평균 171mmHg 약 200mmHg에까지 달한다. 또한, SHR는 콜레스테롤 대사이상, 및 인슐린 저항성도 나타낸다.

실험재료
필요장비 및 소모품

사육실, Cage, 깔집, 동물용 저울, 핀셋, 가위, test tube, 시약스푼, 메스실린더, Mixer 

 
필요시약

American Institute of Nutrition(AIN) 76 또는 AIN 93 식이, Commercial diet 

 
세포주

Spontaneously hypertensive rat 

 
실험방법

1. 실험식이를 준비한다.

1) AIN-76 또는 AIN-93 식이, commercial diet, lab chow 등을 사용할 수 있음.

2) 시험물질의 첨가 농도는 물질의 활성 정도에 따라 차이가 있음.

3) 시험물질의 섭취방법은 식이에 첨가하는 것을 권장함 (단, 시료의 특성상 식이형태의 섭취가 어려울 경우는 존데를 이용하여 경구투여 함)

2. 실험동물을 준비한다. 

1) 실험동물: SHR 모델

2) 군당 마리수: 10마리 내외

3) 실험목적에 따라 성별, 주령에 차이가 있음.

3. 1주일 적응기간이 이후, 몸무게를 측정하고 그룹화한다.

4. 시험물질을 첨가한 식이를 공급(또는 경구투여)한다. 

5. 일정기간동안 사육한다.

1) 체중측정: 사육기간 동안, 매주 1~2회 동일한 시간대에 측정함

2) 식이섭취량: 매 격일로 동일한 시간대(오전 권장)에 측정하여 식이효율을 산출함.

* 식이섭취량(FER, Food efficiency ratio)=체중증가량(g)/식이섭취량(g)

6. 실험 기간이 끝난 후, 혈액과 장기 시료를 채취한다.

1) 실험목적과 분석내용에 따라 채취해야 할 장기를 선택한다.

2) 혈액 및 장기 보관온도에 주의한다.

결과해석

혈행개선 기능서 소재를 공급받은 실험동물의 혈행 관련 인자들이 대조군에 비하여 유의적으로 개선되면 혈행개선 효과가 있는 것으로 판단할 수 있다.

참고문헌 1. Lominadze D, Joshua IG, Schuschke DA. In vivo platelet thrombus formation in microvessels of spontaneously hypertensive rats, Am J Hypertens. 1997 Oct;10(10 Pt 1):1140-6.
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제목 Spontaneously hypertensive rat (SHR) 동물모델 링크 동물모델
실험재료
필요장비 및 소모품

Mixer(Kichen Aid), cage((주)정도비앤피), 물통((주)정도비앤피), 동물용체중계((주)카스), 깔집((주)정도비앤피), 핀셋(덕상종합과학), 가위(KASCO), test tube(SARSTEDT), 시약스푼(덕산종합과학), 메스실린더(덕산종합과학)

 
필요시약

AIN-93G 식이 구성 성분(전분, 카제인, 텍스트린, 셀룰로오스, 비타민, 무기질, L-cystine, choline bitartrate, 설탕, 대두유, tert-butylhydroquinone, Research diets), NaCl(Sigma)

 
실험방법

1. 5주령의 수컷 SHR을 분양받는다. 

Tips: 

- 정상군으로 Wistar-Kyoto rat도 준비한다. 

2. 환경적응 후, 체중을 측정하여 정상군(Wistar-Kyoto rat)와 고혈압군(SHR)로 그룹화하였다. 

3. 식이는 AIN93G 식이를 기초로 하여 아래의 표와 같은 조성으로 조제하여 공급하였다. 

Tips: 

- 이때 AIN76 또는 AIN93 조성으로 시판되는 식이, Lab chow 사용 가능.

Table 1. AIN-93G 식이 조성

 

(g/kg)

함량

Corn starch

39.748

Casein

20.0

Dextrinized cornstarch

13.2

Sucrose

10.0

Soybean oil

7.0

Cellulose

5.0

Mineral mix

3.5

Vitamin mix

1.0

L-Cystine

0.3

Choline bitartrate

0.3

Total

1000

 

4. 환경 적응 후 실험식이와 물을 24시간동안 자유급식(ad libitum)으로 공급하고 10주간 사육한다.

Tips: 

- 사육기간은 실험조건에 따라 설정한다.

5. 실험동물 케이지는 일주일에 한 번 혹은 두 번 교환하여 청결을 유지하도록 한다.

6. 체중은 일주일에 2번 같은 시간에 측정한다.

7. 식이섭취량은 매일 같은 시각에 측정하고, 식이효율은 일주일간 측정된 체중과 같은 기간의 식이섭취량을 이용하여 계산한다.

8. 실험동물을 12시간 절식시킨 후 개체별로 체중을 측정한 뒤 마취하여 채혈한다. 혈액 샘플은 실온에 20~30분간 방치한 후, 원심분리하여 혈청을 분리하여 분석 전까지 -70℃에서 보관한다. 

9. 채혈 한 후에는 간, 신장, 췌장 및 근육 등 을 적출한다. 적출된 조직은 표면에 묻은 혈액을 0.9% 생리식염수로 씻어내고 trimming한 다음, 여지로 수분을 제거한 후 중량을 측정하여 액체질소로 급속 동결하여 분석 전까지 -70℃에서 보관한다.

실험결과 예

출처: Lominadze D et al., 1997

결과해석

SHR은 음성대조군인 WKY보다 소동맥과 소정맥에서 혈전이 생성되는 시간이 현저히 짧으므로 혈액의 흐름이 안 좋아진다는 것을 확인할 수 있다. 여기서 다시 혈전 생성 시간을 길게 만드는 효능이 있는 후보 소재는 혈행 개선 기능성이 있다고 볼 수 있다.

참고문헌 1. Lominadze D, Joshua IG, Schuschke DA. In vivo platelet thrombus formation in microvessels of spontaneously hypertensive rats, Am J Hypertens. 1997 Oct;10(10 Pt 1):1140-6.
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