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인지능력개선

동물실험법

제목 단백질 정량법 (Bradford assay)
구분 인지능력향상 링크 기초실험법
실험배경

단백질 정량이란 샘플(세포, 조직) 내에 포함된 단백질의 양 또는 농도를 구하는 과정을 말한다. 특정 단백질 발현에 차이 여부를 western blot을 이용해서 확인하고 싶을 경우 시료에서 단백질을 추출하여 양을 측정한다. 이는 총 단백질의 양이 동일해야 확인하고자 하는 특정 단백질의 상대적인 값을 비교할 수 있기 때문이다. 또한 효소활성을 측정할 경우에도 총 단백질의 양을 동일하게 맞춘 후 효소를 기질(substrate)에 처리한 후, 단위 시간당 기질의 농도 감소를 통하여, 효소 활성도를 측정한다.

단백질을 정량하는 방법으로는 UV spectrophotometry, Biuret method, BCA method, Lowry method, Bradford method 등이 있다.

UV spectrophotometry 는 방향족 아미노산인 phenylalanine, tyrosine, tryptophan 에 의한 280 nm에서 최대 흡광을 이용한 방법이다. 장점으로는 50 μg-1 mg/ml 범위의 단백질 양이 측정 가능하며 빠르고 단백질 변성이 없다는 것이 있으며, 단점으로는 buffer, pH, salt 등에 영향을 많이 받고 아미노산 조성에 따러서 값이 달라진다는 것이 있다. Biuret 방법은 알칼리 조건 하에서 Cu2+ ion 이 단백질의 peptide nitrogen 에 결합하여, 보라색의 착화합물을 생성하고, 540-560 nm에서 흡광을 나타내는 것을 이용한다. 장점은 아미노산 조성에 따른 차이가 없다는 것이며, 단점은 sensitivity 가 낮다는 것이 있다. BCA 방법은 단백질 용액에 Cu2+ ion 을 반응시킨 후, bicinchoninate (BCA) 가 Tryptophan, tyrosine, cysteine 의 도움으로 Cu2+ ion 과 복합체를 형성하여 자색으로 발색하는 반응을 이용한 것임. Lowry 방법은 두 단계로 이루어지는데 1 단계는 Biuret 반응으로 알칼리 용액에서 Cu2+ ion 과 protein peptide bond 간에 복합체를 형성시켜서 Cu2+ ion 가 Cu+ 로 환원되는 것이고 2단계는 Folin-Ciocalteu reaction 으로 Cu+ 와 tryptophan, tyrosine, cysteine의 radical group이 Folin-Ciocalteu reagent (phosphomolybdate and phosphotungstate complex, 노란색)를 환원시켜서 진한 청색으로 변한다. Bradford assay가 단백질 정량법 중에서 가장 일반적으로 사용된다. Bradford법의 원리는 coomassie brilliant blue G-250(CBBG) 염료가 free dye의 형태로 있을 때 최대 흡광은 465 nm (red) 이지만, 단백질의 아미노산과 결합하여 anionic form일 때의 최대 흡광은 595 nm (blue) 인 특징을 이용하는 것으로 595 nm에서의 흡광도는 단백질의 농도와 비례하므로 정량이 가능하게 된다. 이 방법은 발색 반응이 2분 이내에 완결되며, 1시간까지 안정성이 유지된다. 

실험재료
필요장비 및 소모품

분광광도계, ELISA reader, pipette, pipette tip, 96 well plate, cuvette, tissue homogenizer, 원심분리기, 막자사발 

 
필요시약

Bradford 용액, Bovine serum albumin (BSA), 증류수, 액체질소

 
세포주

 

 
실험방법

1. 일정량의 조직에 homogenization buffer를 넣고 조직균질기를 이용하여 균질화시킨다.

2. 균질액을 4℃에서 원심분리하고, 상층액을 취한다.

3. 표준액인 BSA를 농도별로 희석하여 준비한다.

4. Bradford 시약은 증류수로 희석하여 준비한다.

5. 표준액 BSA와 시료에 bradford reagent solution을 첨가한다.

6. 상온에서 5분간 반응시킨다.

7. 595 nm에서 흡광도 측정한다. 

흡광도 측정을 위해 microplate readers 기계를 이용한다.

결과해석

흡광도가 높을수록 단백질의 함량은 많은 것을 의미한다.

참고문헌 1. Han XX, Xie Y, Zhao B, Ozaki Y., Highly sensitive protein concentration assay over a wide range via surface-enhanced Raman scattering of Coomassie brilliant blue., Anal. Chem., 82(11) p4325-28, 2010
2. Compton SJ, Jones CG., Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay., Anal. Biochem., 151(2) p369-74, 1985
3. Potter TM, Neun BW, Stern ST., Assay to detect lipid peroxidation upon exposure to nanoparticles., Methods. Mol. Biol., 697() p181-9, 2011
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제목 단백질 정량법 (Bradford assay) 링크 기초실험법
실험재료
필요장비 및 소모품

분광광도계, ELISA reader, pipette, pipette tip, 96 well plate, cuvette, tissue homogenizer, 원심분리기, 막자사발

 
필요시약

Bradford 용액, Bovine serum albumin (BSA), 증류수, 액체질소

 
실험방법

1. 일정량의 조직에 homogenization buffer를 넣고 조직균질기를 이용하여 균질화시킨다.

2. 균질액을 4℃에서 원심분리하고, 상층액을 취한다.

3. 표준액인 BSA를 농도별로 희석하여 준비한다.

4. Bradford 시약은 증류수로 희석하여 준비한다.

5. 표준액 BSA와 시료에 bradford reagent solution을 첨가한다.

6. 상온에서 5분간 반응시킨다.

7. 595 nm에서 흡광도 측정한다. 

흡광도 측정을 위해 microplate readers 기계를 이용한다.

실험결과 예

 

결과해석

흡광도가 높을수록 단백질의 함량은 많은 것을 의미한다.

참고문헌 1. Han XX, Xie Y, Zhao B, Ozaki Y., Highly sensitive protein concentration assay over a wide range via surface-enhanced Raman scattering of Coomassie brilliant blue., Anal. Chem., 82(11) p4325-28, 2010

2. Compton SJ, Jones CG., Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay., Anal. Biochem., 151(2) p369-74, 1985

3. Potter TM, Neun BW, Stern ST., Assay to detect lipid peroxidation upon exposure to nanoparticles., Methods. Mol. Biol., 697() p181-9, 2011
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