국민의 더 안전하고 건강한 삶을 위한
건강기능식품 플랫폼

  • 통합검색
  • 인정현황
  • 내게맞는실험법
  • 기능지표성분분석법
  • top

인지능력개선

동물실험법

제목 RNA 추출 및 cDNA 합성
구분 인지능력향상 링크 기초실험법
실험배경

RNA를 추출하는 방법으로는 phenol이 들어있는 Trizol을 이용하는 방법과 column방식으로 나눌 수 있다. Trizol은 chloroform으로 단백질 (유기용매층), DNA (중간층), RNA (수용액층)를 분리한 후 isopropanol로 침전시켜 RNA를 얻는 방법이다. 최근에 많이 이용되고 있는 column방식은 RNA에 결합할 수 있는 silica column에 샘플을 넣어서 RNA를 추출하는 방법으로 ethanol로 침전시킨 RNA를 column에 binding 시킨 후 물로 elution하여 RNA를 얻는 방법이다. RNA를 추출하고 난 후 핵산의 흡광도 측정을 통해 RNA의 순도를 측정할 수 있다. 핵산의 purine과 pyrimidine 염기는 방향족 구조로 인해 자외선을 흡수하게 되는데 260nm에서 최대 흡수도를 가지므로 RNA와 DNA는 260nm에서 흡광도를 측정하고 단백질에 포함된 tyrosine, tryptophan, phenylalanine이 280 nm에서 최대 흡수도를 보이므로 260nm와 280nm에서 측정한 흡광도값을 기준으로 하여 분리된 핵산 용액이 어느정도의 단백질을 함유하고 있는지 알 수 있다. 일반적으로 A260와 A280의 비가 1.8 이상일 경우 순수한 DNA나 RNA로 간주한다. 추출된 RNA는 real-time PCR, microarray, RNA sequncing 과 같은 assay에 이용될 수 있다

실험재료
필요장비 및 소모품

원심분리기, homogenize machine, RNA용 pipet tip, Nanodrop, PCR cycler, RNA용 tube

 
필요시약

RNase-free water, Ethanol, RNA extraction kit, Oligo dT primer

 
세포주

 

 
실험방법

 

결과해석

1.RNA 추출

1) 조직과 bead를 멸균한 tube에 넣고 lysis buffer 또는 trizol을 넣고 homogenize machine을 이용하여 균질화한다.

- 조직의 밀도 및 양에 따라 bead의 재질이나 양을 조절하여 넣는 것이 좋다.

2) 균질화한 조직을 필터 tube와 collection tube를 이용하여 원심분리한다.

3) collection tube에 모인 용액과 70% 에탄올과 파이펫으로 섞은 뒤 새로운 필터 tube와 collection tube를 이용하여 원심분리한 후 collection tube를 교체한다.

4) 필터 tube에 Membrane desalting buffer를 넣은 후 원심분리한 뒤 collection tube를 교체한다.

5) 필터 tube에 rDNase reaction mixture를 넣고 15분간 상온에서 반응시킨 후 wash buffer를 넣고 원심분리한다. 필터 tube는 그대로 두고 collection tube를 교체한다.

6) 필터 tube에 wash buffer를 넣고 원심분리한 후 collection tube를 교체한다.

7) 필터 tube에 wash buffer를 넣고 원심분리한 다음 한번 더 원심분리하여 용액을 제거해준다.

8) Collection tube를 뚜껑이 있는 tube로 교체 후 RNase free water를 넣고 원심분리하여 RNA를 수거한다.

9) UV spectrophotometer를 이용하여 RNA의 순도 (A260/A280)와 농도 (ng/㎕)를 확인하고 각 샘플의 농도를 일정하게 맞춘다. 

10) RNA는 다음 실험에 이용할 때 까지 -80℃에서 보관한다.  

 

2. cDNA 합성

1) RNA, oligo dT primer, reverse transcriptase, dNTP등과 함께 PCR cycler를 이용하여 cDNA를 합성한다.

2) TaqMan assay를 이용할 경우 oligo dT primer 대신에 측정하려고 하는 유전자와 endogenous control 유전자의 primer를 이용하여 유전자 특이적 cDNA를 합성한다.

3) cDNA는 다음 실험에 이용할 때 까지 -20℃에서 보관한다.

참고문헌
목록보기
제목 RNA 추출 및 cDNA 합성 링크 기초실험법
실험재료
필요장비 및 소모품

원심분리기, homogenize machine, RNA용 pipet tip, Nanodrop, PCR cycler, RNA용 tube

 
필요시약

RNase-free water, Ethanol, RNA extraction kit, Oligo dT primer

 
실험방법

1.RNA 추출

1) 조직과 bead를 멸균한 tube에 넣고 lysis buffer 또는 trizol을 넣고 homogenize machine을 이용하여 균질화한다.

- 조직의 밀도 및 양에 따라 bead의 재질이나 양을 조절하여 넣는 것이 좋다.

2) 균질화한 조직을 필터 tube와 collection tube를 이용하여 원심분리한다.

3) collection tube에 모인 용액과 70% 에탄올과 파이펫으로 섞은 뒤 새로운 필터 tube와 collection tube를 이용하여 원심분리한 후 collection tube를 교체한다.

4) 필터 tube에 Membrane desalting buffer를 넣은 후 원심분리한 뒤 collection tube를 교체한다.

5) 필터 tube에 rDNase reaction mixture를 넣고 15분간 상온에서 반응시킨 후 wash buffer를 넣고 원심분리한다. 필터 tube는 그대로 두고 collection tube를 교체한다.

6) 필터 tube에 wash buffer를 넣고 원심분리한 후 collection tube를 교체한다.

7) 필터 tube에 wash buffer를 넣고 원심분리한 다음 한번 더 원심분리하여 용액을 제거해준다.

8) Collection tube를 뚜껑이 있는 tube로 교체 후 RNase free water를 넣고 원심분리하여 RNA를 수거한다.

9) UV spectrophotometer를 이용하여 RNA의 순도 (A260/A280)와 농도 (ng/㎕)를 확인하고 각 샘플의 농도를 일정하게 맞춘다. 

10) RNA는 다음 실험에 이용할 때 까지 -80℃에서 보관한다.  

 

2. cDNA 합성

1) RNA, oligo dT primer, reverse transcriptase, dNTP등과 함께 PCR cycler를 이용하여 cDNA를 합성한다.

2) TaqMan assay를 이용할 경우 oligo dT primer 대신에 측정하려고 하는 유전자와 endogenous control 유전자의 primer를 이용하여 유전자 특이적 cDNA를 합성한다.

3) cDNA는 다음 실험에 이용할 때 까지 -20℃에서 보관한다.

실험결과 예

 

결과해석

 

참고문헌
첨부파일
목록보기