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인지능력개선

동물실험법

제목 Western blotting
구분 인지능력향상 링크 기초실험법
실험배경

Western blotting은 여러 단백질의 혼합물로부터 특정단백질을 확인하고자 할 때, 찾으려는 단백질에 대한 항체를 사용하여 항원-항체 반응을 일으킴으로써 특정단백질의 존재여부를 확인하는 방법 중에 하나이다. 분석하고자 하는 단백질 샘플을 SDS-PAGE(전기영동)에 걸어 크기별로 분리한 다음 Polyvinylidene difluoride(PVDF)와 같은 membrane에 transfer한 후 1차 항체를 결합시킨다. 그다음 1차 항체에 결합하여 발색반응을 일으키는 효소를 붙여 발색정도를 필름에 노출시켜 필름을 현상하여 발색정도를 확인함으로써 특정 단백질의 양을 추정할 수 있다.​

실험재료
필요장비 및 소모품

전기영동장치, transfer 장치, power supply, glass plate, comb, spacer, cassette, membrane(PVDF 또는 nitrocellulose), 원심분리기, OHP film, pipette, pipette tip, rotary shaker, fiber pad, test tube, 3MM paper, 핀셋, ELISA reader, 96-well plate, tissue homogenizer, 분광광도계, 플라스틱통, cuvette​

 
필요시약

Lysis buffer, Tris, glycerol, SDS, bromophenol blue, 2-mercaptoethanol, acrylamide, bis-acrylamide, ammonium persulfate, TEMED, glycine, Coomassie gel stain solution, methanol, buthanol, Ponceau S solution, skim milk, bovine serum albumin, NaCl, Tween20, primary antibody (IRS-1), HRP-linked secondary antibody, ECL plus detection kit, bradford solution, Developer, Fixer, PBS(또는 TBS)​

 
세포주

 

 
실험방법

1. 시료의 준비

시료(간, 지방, aorta, muscle 등)에서 단백질을 추출하여 Bradford assay를 통해 단백질 정량을 한다. [SOP A13094. 단백질 정량]

 

2. Gel 제조

1) 확인하고자하는 단백질의 분자량에 따라 acrylamide %를 달리하여 필요한 만큼 seperating solution을 준비한다.

2) Gel unit를 장치한다.

3) Seperating gel solution을 유리판 사이에 주입하고 약 20~30분간 방치하여 gel 만든다.

- Tip: Seperating gel 넣은 후 바로 멸균수나 70% EtOH을 넣어주어 gel 의 윗부분이 고르게 펴지고 gel 이 굳는 동안 수분이 날라가는 것을 방지한다.

4) 5% Stacking solution을 준비하여 seperating gel 위에 뿌려준 다음 comb 끼우고 방치한다.

5) Gel이 응고되면 comb를 제거하고 주변의 kit도 제거한다.

6) Gel이 굳어있는 유리판을 electrophoresis kit에 고정시킨다.

 

3. Running 

1) 유리판과 electrophoresis kit사이에 running buffer를 가득 채운다.

2) 각 well에 단백질양을 측정한 시료와 marker를 주입한다.

3) Electrophoresis kit를 연결하고 100 volt, 90분으로 running한다.

4) 전기영동이 끝난 gel을 kit와 분리하여 gel을 transfer buffer에 침지시킨다.

 

4. Transfer

1) Transfer kit를 이용하여 fiber pad, filter paper, loading gel, membrane, filter paper, fiber pad 순으로 올려서 고정시킨다.

2) Kit에 transfer buffer를 부어서 채운 뒤 아이스팩을 넣고 350 mA, 2hr, running시킨다.

3) Transfer가 끝난 뒤 Membrane을 취하여 실온에서 2시간동안 5% skim milk/TBST으로 brocking한다.

4) TBST(또는 PBST)로 10분 동안 washing(3회 반복)

5) Primary antibody를 넣고 상온(또는 4℃ overnight)에서 2시간 정도 shaking한다.

6) TBST(또는 PBST)로 10분 동안 washing(3회 반복)

7) Secondary antibody를 상온(또는 4℃ overnight)에서 1시간 정도 shaking한다.

8) TBST(또는 PBST)로 10분 동안 washing(3회 반복)

 

5. ECL & 현상

1) 현상 cassette에 OHP 필름을 덮고, 그 위에 membrane을 올린다.

2) ECL detection solution을 뿌린다.

3) 암실에서 필름을 넣고 현상한 다음 밴드를 확인한다.

- Membrane을 ECL solution 으로 감광한 후 Gel doc 과 같은 기계로 사진을 찍을 수도 있음.​ 

결과해석

현상한 필름의 밴드 density를 통하여 확인하고자 하는 단백질의 발현량을 확인한다.​

참고문헌 1. Laemmli, U.K., SDS-discontinuouspolyacrylamidegel electrophoresis; SDS-PAGE., Nature, 227() p680-685, 1970
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제목 Western blotting 링크 기초실험법
실험재료
필요장비 및 소모품

전기영동장치, transfer 장치, power supply, glass plate, comb, spacer, cassette, membrane(PVDF 또는 nitrocellulose), 원심분리기, OHP film, pipette, pipette tip, rotary shaker, fiber pad, test tube, 3MM paper, 핀셋, ELISA reader, 96-well plate, tissue homogenizer, 분광광도계, 플라스틱통, cuvette​

 
필요시약

Lysis buffer, Tris, glycerol, SDS, bromophenol blue, 2-mercaptoethanol, acrylamide, bis-acrylamide, ammonium persulfate, TEMED, glycine, Coomassie gel stain solution, methanol, buthanol, Ponceau S solution, skim milk, bovine serum albumin, NaCl, Tween20, primary antibody (IRS-1), HRP-linked secondary antibody, ECL plus detection kit, bradford solution, Developer, Fixer, PBS(또는 TBS)​

 
실험방법

1. 시료의 준비

시료(간, 지방, aorta, muscle 등)에서 단백질을 추출하여 Bradford assay를 통해 단백질 정량을 한다. [SOP A13094. 단백질 정량]

 

2. Gel 제조

1) 확인하고자하는 단백질의 분자량에 따라 acrylamide %를 달리하여 필요한 만큼 seperating solution을 준비한다.

2) Gel unit를 장치한다.

3) Seperating gel solution을 유리판 사이에 주입하고 약 20~30분간 방치하여 gel 만든다.

- Tip: Seperating gel 넣은 후 바로 멸균수나 70% EtOH을 넣어주어 gel 의 윗부분이 고르게 펴지고 gel 이 굳는 동안 수분이 날라가는 것을 방지한다.

4) 5% Stacking solution을 준비하여 seperating gel 위에 뿌려준 다음 comb 끼우고 방치한다.

5) Gel이 응고되면 comb를 제거하고 주변의 kit도 제거한다.

6) Gel이 굳어있는 유리판을 electrophoresis kit에 고정시킨다.

 

3. Running 

1) 유리판과 electrophoresis kit사이에 running buffer를 가득 채운다.

2) 각 well에 단백질양을 측정한 시료와 marker를 주입한다.

3) Electrophoresis kit를 연결하고 100 volt, 90분으로 running한다.

4) 전기영동이 끝난 gel을 kit와 분리하여 gel을 transfer buffer에 침지시킨다.

 

4. Transfer

1) Transfer kit를 이용하여 fiber pad, filter paper, loading gel, membrane, filter paper, fiber pad 순으로 올려서 고정시킨다.

2) Kit에 transfer buffer를 부어서 채운 뒤 아이스팩을 넣고 350 mA, 2hr, running시킨다.

3) Transfer가 끝난 뒤 Membrane을 취하여 실온에서 2시간동안 5% skim milk/TBST으로 brocking한다.

4) TBST(또는 PBST)로 10분 동안 washing(3회 반복)

5) Primary antibody를 넣고 상온(또는 4℃ overnight)에서 2시간 정도 shaking한다.

6) TBST(또는 PBST)로 10분 동안 washing(3회 반복)

7) Secondary antibody를 상온(또는 4℃ overnight)에서 1시간 정도 shaking한다.

8) TBST(또는 PBST)로 10분 동안 washing(3회 반복)

 

5. ECL & 현상

1) 현상 cassette에 OHP 필름을 덮고, 그 위에 membrane을 올린다.

2) ECL detection solution을 뿌린다.

3) 암실에서 필름을 넣고 현상한 다음 밴드를 확인한다.

- Membrane을 ECL solution 으로 감광한 후 Gel doc 과 같은 기계로 사진을 찍을 수도 있음.​ 

실험결과 예

 

결과해석

현상한 필름의 밴드 density를 통하여 확인하고자 하는 단백질의 발현량을 확인한다.​

참고문헌 1. Laemmli, U.K., SDS-discontinuouspolyacrylamidegel electrophoresis; SDS-PAGE., Nature, 227() p680-685, 1970
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