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체지방감소

동물실험법

제목 RNA 추출 및 cDNA 합성
구분 체지방감소 링크 기초실험법
실험배경
RNA를 추출하는 방법으로는 phenol이 들어있는 Trizol을 이용하는 방법과 column방식으로 나눌 수 있다. Trizol은 chloroform으로 단백질 (유기용매층), DNA (중간층), RNA (수용액층)를 분리한 후 isopropanol로 침전시켜 RNA를 얻는 방법이다. 최근에 많이 이용되고 있는 column방식은 RNA에 결합할 수 있는 silica column에 샘플을 넣어서 RNA를 추출하는 방법으로 ethanol로 침전시킨 RNA를 column에 binding 시킨 후 물로 elution하여 RNA를 얻는 방법이다. RNA를 추출하고 난 후 핵산의 흡광도 측정을 통해 RNA의 순도를 측정할 수 있다. 핵산의 purine과 pyrimidine 염기는 방향족 구조로 인해 자외선을 흡수하게 되는데 260nm에서 최대 흡수도를 가지므로 RNA와 DNA는 260nm에서 흡광도를 측정하고 단백질에 포함된 tyrosine, tryptophan, phenylalanine이 280 nm에서 최대 흡수도를 보이므로 260nm와 280nm에서 측정한 흡광도값을 기준으로 하여 분리된 핵산 용액이 어느정도의 단백질을 함유하고 있는지 알 수 있다. 일반적으로 A260와 A280의 비가 1.8 이상일 경우 순수한 DNA나 RNA로 간주한다. 추출된 RNA는 real-time PCR, microarray, RNA sequncing 과 같은 assay에 이용될 수 있다
실험재료
필요장비 및 소모품
원심분리기, homogenize machine, RNA용 pipet tip, Nanodrop, PCR cycler, RNA용 tube
 
필요시약
RNase-free water, Ethanol, RNA extraction kit, Oligo dT primer
 
세포주

 

 
실험방법 1.RNA 추출
1) 조직과 bead를 멸균한 tube에 넣고 lysis buffer 또는 trizol을 넣고 homogenize machine을 이용하여 균질화한다.
- 조직의 밀도 및 양에 따라 bead의 재질이나 양을 조절하여 넣는 것이 좋다.
2) 균질화한 조직을 필터 tube와 collection tube를 이용하여 원심분리한다.
3) collection tube에 모인 용액과 70% 에탄올과 파이펫으로 섞은 뒤 새로운 필터 tube와 collection tube를 이용하여 원심분리한 후 collection tube를 교체한다.
4) 필터 tube에 Membrane desalting buffer를 넣은 후 원심분리한 뒤 collection tube를 교체한다.
5) 필터 tube에 rDNase reaction mixture를 넣고 15분간 상온에서 반응시킨 후 wash buffer를 넣고 원심분리한다. 필터 tube는 그대로 두고 collection tube를 교체한다.
6) 필터 tube에 wash buffer를 넣고 원심분리한 후 collection tube를 교체한다.
7) 필터 tube에 wash buffer를 넣고 원심분리한 다음 한번 더 원심분리하여 용액을 제거해준다.
8) Collection tube를 뚜껑이 있는 tube로 교체 후 RNase free water를 넣고 원심분리하여 RNA를 수거한다.
9) UV spectrophotometer를 이용하여 RNA의 순도 (A260/A280)와 농도 (ng/㎕)를 확인하고 각 샘플의 농도를 일정하게 맞춘다. 
10) RNA는 다음 실험에 이용할 때 까지 -80℃에서 보관한다.  
 
2. cDNA 합성
1) RNA, oligo dT primer, reverse transcriptase, dNTP등과 함께 PCR cycler를 이용하여 cDNA를 합성한다.
2) TaqMan assay를 이용할 경우 oligo dT primer 대신에 측정하려고 하는 유전자와 endogenous control 유전자의 primer를 이용하여 유전자 특이적 cDNA를 합성한다.
3) cDNA는 다음 실험에 이용할 때 까지 -20℃에서 보관한다.​

결과해석
 
참고문헌
목록보기
제목 RNA 추출 및 cDNA 합성 링크 기초실험법
실험재료
필요장비 및 소모품
원심분리기(eppendorf), Nanodrop(Termo), RNA용 pipet tip(QSP), PCR cycler(eppendorf), homogenize machine(MP bio), RNA용 tube(QSP)
 
 
필요시약
RNase water(GIBCO), Ethanol(Sigma), RNA extraction kit(MN), Oligo dT primer(iNtron) 
 
실험방법
1. RNA 추출
1) 조직 30mg과 bead를 멸균한 tube에 넣고 RNA 분리 kit (MN)에 있는 RA1 350ul와 3.5 μl β-mercaptoethanol 을 넣은 뒤 6m/s의 속도로 40초간 MP homogenize 기계를 이용하여 균질화한다.
Tips:
- 조직의 무게를 잴때는 RNAase가 활성화되지 않도록 액제질소를 이용하여 분쇄하거나 드라이아이스위에서 신속하게 시행한다.
- RNase 오염을 방지하기위해 장갑을 착용하고 RNase 제거 용액(예. RNase jap)을 사용하여 테이블. 파이펫 등을 닦아주고, RNase free tube와 필터팁을 사용하며 침속에는 RNase가 있기 때문에, 가급적 말하지 않는다.
 - 조직에 따라 필요량이 다를 수 있다. 예를 들어 지방조직의 경우, 다른 조직에 비해 많은 양이 필요함.
2) 균질화한 조직을 보라색 링이 달려있는 필터 tube와 collection tube에 넣고 11,000g에서 1분간 원심분리한다.
3) 필터 tube를 버리고 collection tube에 모인 용액에 70% 에탄올를 넣고 파이펫으로 섞는다.
4) 3번에서 혼합한 용액을 파란색 링이 달려있는 새로운 필터 tube와 collection tube에 넣고 11,000g에서 30초간 원심분리한다.
5) 파란색 링의 필터 tube는 그대로 두고 새로운 collection tube로 교체한다.
6) 필터 tube에 350 μl MBD buffer를 넣은 후 11,000g에서 1분간 원심분리한다.
7) 파란색 링의 필터 tube는 그대로 두고 새로운 collection tube로 교체한다.
8) 파란색 링의 필터 tube에 rDNase reaction mixture 95 μl를 넣고 15분간 상온에서 반응시킨다.
Tips:
- rDNase reaction mixture는 10 μl reconstituted rDNase와 90 μl reaction buffer를 섞어서 만들어두며 사용하기 직전에 만들어 15분동안 상온에서 반응시킨 후 사용한다.
9) 그 다음 RA2 wash buffer를 200 μl 넣고 11,000g에서 30초간 원심분리한다.
10) 파란색 링의 필터 tube는 그대로 두고 새로운 collection tube로 교체한다.
11) 파란색 링의 필터 tube에 600 μl RA3 wash buffer를 넣고 11,000g에서 30초간 원심분리한다.
12) 파란색 링의 필터 tube는 그대로 두고 새로운 collection tube로 교체한다.
13) 파란색 링의 필터 tube에 250 μl RA3 wash buffer를 넣고 11,000g에서 30초간 원심분리한다.
Tips :
- 수분을 모두 제거하기 위해 한번 더 원심분리 해준다.
14) collection tube를 뚜껑이 있는 tube로 교체 후 40 μl RNase free water를 넣고 11,000g에서 1분간 원심분리하여 RNA를 수거한다.
15) Nanodrop을 이용하여 RNA 농도 (ng/μl)를 확인한다.
16) 증류수 (1.5 μl)로 blank를 먼저 측정하고 RNA 샘플을 1.5 μl 넣어 농도를 측정한다.
17) 측정한 RNA의 농도는 RNase free 증류수를 이용하여 1 ng/μl 로 희석하여 농도를 맞춰준다.
 
2. cDNA 합성
1) Oligo dT primer, reverse transcriptase, dNTP등이 들어있는 tube에 RNA (1ng/ul) 20㎕를 넣는다.
2) Tube의 뚜껑을 닫고 vortex를 이용하여 잘 섞어준다.
3) PCR cycler를 이용하여 cDNA를 합성한다.
- 조건 : cDNA synthesis 45 ℃ 60분, RT inactivation step 95 ℃ 5분
- 이 조건은 primer에 따라 다를 수 있음
4) cDNA 합성이 다 끝난 후 원심분리하여 용액을 모은 후 다음 실험 전까지 -20℃에서 보관한다.
실험결과 예
결과해석
OD 260/280 ratio로 RNA purity를 측정하는데, 이 값이 1.8 이상인 RNA만 실험에 사용하도록 하며 RNA는 불안정하므로 추출 후 빠른시일내로 cDNA로 합성하여둔다.
참고문헌
첨부파일
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