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체지방감소

동물실험법

제목 Quantitative Real Time PCR
구분 체지방감소 링크 기초실험법
실험배경
PCR (polumerase chain reaction : 중합효소연쇄반응)은 특정 DNA 부위를 특이적으로 반복 합성하여 시험관내에서 원하는 DNA 분자를 증폭시키는 방법으로, 아주 적은 양의 DNA를 이용하여 많은 양의 DNA 합성이 가능하게 해준다 (그림 1). 따라서, PCR은 특정 유전자가 얼마나 많이 발현되었는지 확인하기 위해 실시한다.
 

그림 1. PCR 원리

일반적인 PCR의 목적이 DNA를 template로 해서 특정한 유전자 서열을 증폭하는 것이라고 정의한다면 quantitative PCR (이하 qPCR)은 PCR 을 통해 특정 유전자의 발현량을 정량하는 것이 목적이다. 분석방법으로는 TaqMan assay, Molecular Beacon, SYBR Green 을 이용하는 세가지 방법이 있다 (그림 2). TaqMan assay나 Molecular Beacon 는 PCR product와 상보적으로 결합할 수 있는 probe를 필요로 한다. TaqMan assay의 경우 양끝에 형광물질 (fluorscent)와 파장을 잡아먹는 물질 있어서 TaqMan assay의 경우에는 매 사이클이 돌아갈 때마다 product양에 비례해서 형광이 줄어 들게 되고 Molecular Beacon의 경우 늘어나며 이 형광의 변화량을 측정하여 초기 template의 양을 측정한다. SYBR Green의 경우 dual strand와 결합할 때만 형광을 내는 점을 이용하여 매 사이클 늘어나는 형광의 양을 체크해서 정량한다. TaqMan assay나 Molecular Beacon의 경우 정확하고 비특이적으로 형광을 발산하지 않아 정확하다는 것과 product크기에 상관없이 형광이 일정하다는 장점이 있지만 primer와 product에 따라서 probe를 따로 제작해줘야 한다는 단점이 있다. SYBR Green을 이용하는 경우 염기서열과 상관없이 이중나선과 반응해서 형광을 발산하기에 부정확할 수도 있고 product의 크기에 따라 형광의 세기가 달라지는 단점이 있지만 어느 PCR에나 적용할 수 있고 새로 probe를 만들 필요가 없다는 장점이 있다.

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
그림 2. SYBR Green dye (A), TaqMan probe (B), Molecular Beacon (C) 원리
실험재료
필요장비 및 소모품
Real time PCR, 96 well plate, RNA용 pipet tip
 
필요시약
RNase water, ethanol, chloroform, Real-time PCR primers, SYBR green
 
세포주
 
실험방법
1. SYBR Green 또는 TaqMan PCR Master mix, cDNA, primers, RNase-free water를 혼합한다.
2. PCR전용 plate에 1)에서 혼합한 용액을 넣는다.
3. Real time PCR에 넣고 반응시간에 따라 PCR를 실시한다.
4. PCR의 과정은 90-95℃ 로 가열하여 DNA를 변성시키고(denaturation), annealing온도로 바꿔주어 primer와 결합할 수 있도록 하며 그 다음 DNA의 합성(polymerization)과정을 통해 원하는 DNA를 증폭시킨다.
Tips : annealing 온도는 각 primer 마다 고유의 Tm 값을 고려하여 그 이상으로 설정하도록 한다.
5. PCR이 끝나고 나면 각 유전자마다 특정 cycle수 값을 의미하는 CT(critical threshold)값을 구할 수 있는데  
이 값은 실험시마다 값이 다르므로 CT값을 직접 비교하는 것은 의미가 없다. 따라서 각 실험값을 normalize한 다음 그 상대적인 비율을 비교하게 된다.

A : 임의로 사용한 housekeeping 유전자 발현값
B : 증폭하고자 하는 유전자 발현양
 
결과해석
대조군과 비교하여 상대적 비율값이 높을 수록 해당 유전자의 발현이 높다고 할 수 있다.
참고문헌 1. Kalinowski, D.P., Illenye, S. and Van Houten, B., Analysis of DNA damage and repair in murine leukemia L1210 cells using a quantitative polymerase chain reaction assay., Nucleic Acids Res., 20(13) p3485-94, 1992
2. Berndt, C., Bebenroth, M., Oehlschlegel, K., Hiepe, F. and Schössler, W., Quantitative polymerase chain reaction using a DNA hybridization assay based on surface-activated microplates., Anal. Biochem., 225(2) p252-7, 1995
3. Yu, H., Bruno, J.G., Cheng, T.C., Calomiris, J.J., Goode, M.T. and Gatto-Menking, D.L., A comparative study of PCR product detection and quantitation by electro-chemiluminescence and fluorescence., J. Biolumin. Chemilumin., 10(4) p239-45, 1995
4. Vandevyver C, Motmans K, Raus J., Quantification of cytokine mRNA expression by RT-PCR and electrochemiluminescence., J. Genome Res., 5(2) p195-201, 1995
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제목 Quantitative Real Time PCR 링크 기초실험법
실험재료
필요장비 및 소모품
RT-PCR(Roche), 96 well plate(Roche), RNA용 pipett tip(QSP), RNA용 tube(QSP)
 
필요시약
RNase water(Gibco), Real-time PCR primers(Macrogen), SYBRgreen(TOYOBO)
 
실험방법
1. 샘플의 cDNA 2 ㎕ + 증폭시키고자 하는 유전자 Primer forward 0.8 ㎕ + 증폭시키고자 하는 유전자 Primer reverse 0.8 ㎕ + SYBR Green I master mix 10 ㎕ + RNase free water 6.4 ㎕를 RNA용 tube에 넣어 섞어준다.
-Tips: primer stock은 10mM이면 충분하다2. 각 샘플마다 β-actin과 같은 housekeeping 유전자의 primer로 1번과 같이 준비한다.
샘플의 cDNA 2 ㎕ + housekeeping 유전자 Primer forward 0.8 ㎕ + housekeeping 유전자 Primer reverse 0.8 ㎕ + SYBR Green I master mix 10 ㎕ + RNase free water 6.4 ㎕
3. 증폭시키고자 하는 유전자의 음성대조군으로 샘플 cDNA 대신에 RNase free water 2㎕ 넣어 RNA용 tube에 넣어준다.
4. PCR용 96 well plate에 1),2),3)에서 만들어놓은 용액을 넣는다. 음성대조군, 증폭시키고자하는 유전자, housekeeping 유전자 순서로 각 well의 위치를 정하여 넣는다.
5. 확인하고자 하는 유전자의 primer에 맞는 TM값을 기준으로 PCR을 디자인한다.
6. qRT-PCR 조건은 95℃에서 10분간 predenaturation 시행한 후 95℃에서 20초간 denaturation, 72℃에서 30초간 annealing과 extension하고, scanning하는 과정을 40회 반복하였으며, melting curve 분석은 65~95℃에서 4.4℃씩 1초간 시행한다.
Tips:
- 이 조건은 제작한 primer에 따라 다르다.
7. PCR이 끝나고 난 뒤 CT값을 기준으로 실험값을 normalize한 다음 대조군을 기준으로 그 상대적인 유전자 발현량을 확인한다.
-Tips: 실험이 잘 되었는지 확인하기 위해서 (primer가 specific 했는지 등) melting curve를 확인한다. 하나의 peak가 나타날 때 primer가 specific 하게 반응이 잘 되었다고 할 수 있다.
실험결과 예

 
1. PCR 증폭 및 melting curv 그래프
결과해석
각 샘플의 CT값을 계산하여 샘플 A를 기준으로 normalize한 값으로 유전자 발현 정도를 확인한다.
Sample
Name
RQ Cт Mean ΔCт Mean ΔΔCт
A 1 21.51388 21.51388 1.250864 0
B 1.745219 21.01323 21.01323 0.4474564 -0.80341
C 0.372559 21.81999 21.81999 2.6753216 1.424458
D 0.34318 22.88664 22.88664 2.7938251 1.542961
E 0.245588 21.95273 21.95273 3.2765503 2.025686
 
참고문헌
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