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체지방감소

동물실험법

제목 CPT-1 유전자 발현 측정
구분 체지방감소 링크 지방분해 증가
실험배경
Carnitine Palmitoyltransferase-1 (CPT-1)은 미토콘드리아 효소로써 미코콘드리아 막 외부의 긴 사슬 지방산을 carnitine을 이용하여 막 안으로 수송하는 역할을 한다. CPT-1의 발현이 증가되면 긴 사슬 지방산을 수송이 증가하고 β-산화가 늘어나기 때문에, 식품소재의 항비만 효능을 평가하기 위한 하나의 바이오마커로 활용할 수 있다
실험재료
필요장비 및 소모품
Pipette, RNA용 pipet tip, RNA용 EP tube, Alutoclave, real time PCR, 분광광도계, 저울, 핀셋, 조직균질기(또는 막자사발), 96 well plate(PCR용), vortex, 원심분리기
 
필요시약
RNas Wiper, Trizol reagent(또는 RNA extraction kit), RNase-free water, reverse transcriptase, 10X RT buffer, Oligo dT primer, dNTP mix,  CPT-1 forward primer, CPT-1 reverse primer, ethanol, PCR master mix (SYBR green 또는 Taqman), 액체질소, 클로르포름, 이소프로판올
 
세포주

 

 
실험방법
1. 조직에서 total RNA를 Trizol reagent(또는 RNA 분리 kit)을 이용하여 추출하고, 순도 및 함량을 확인한다. [SOP A13111. RNA 추출 및 cDNA 합성] 참조
2. 샘플별로 추출한 RNA 함량을 동일하게 맞춘다.
3. 추출한 RNA, oligo(DT) primer, dNTP, reverse transcriptase, 10X RT buffer. RNAase inhibitor, RNAase free water를 이용하여 cDNA를 합성한다. [SOP A13111. RNA 추출 및 cDNA 합성] 참조
4. 실험동물의 종에 맞도록 CPT-1 primer를 제작한다.
Tips : 이때 base pair가 20±2bp 정도가 적절한 길이로 권장되어진다.제작시에는 적절한 melting temperature (Tm값)을 가질 수 있도록 G:C 비율 등을 고려하여 design 하는 것이 중요하다.
5. PCR 튜브에 합성한 cDNA, CPT-1 forward primer, CPT-1 reverse primer, PCR Master mix를 첨가한다.
6. 제작된 primer에 맞도록 반응온도와 cycle을 조절하여 quantitative RT-PCR을 실시한다
7. 2△△CT방법을 사용하여 CPT-1 유전자의 발현양을 정량한다. 이때 endogenous control 유전자로 normalization한다. [SOP A13112 Qunatitative Real Time PCR] 참조 
결과해석 CPT-1 mRNA 발현이 증가하면 지방산의  β산화가 촉진된 것으로 판단할 수 있다.
참고문헌 1. SM Park, DS Kim, S Kang., Gastrodia elata Blume water etracts improve insulin resistance by decreading body fat in diet-induced obese rats: vanillin and 4-hydroxybenzaldehyde are the bioactive candidates., Eur. J. Nutr., 50() p107-18, 2011
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제목 CPT-1 유전자 발현 측정 링크 지방분해 증가
실험재료
필요장비 및 소모품
Pipette(Eppendorf), RNA용 pipet tip(Eppendorf), RNA용 EP tube(QSP), Alutoclave(Daeil engineering), real time PCR(Applied Biosystems), 분광광도계(Jasco), 저울(Satorious), 핀셋(덕산종합과학), 조직균질기(MP Bio), PCR용 96 well plate(Applied Biosystems), vortex(Ika works), 원심분리기(Eppendorf)
 
필요시약
RNas Wiper(iNtron), RNA extraction kit(MN), Oligo dT primer RT Premix Kit(cDNA PreMix Kit, iNtron), RNase-free water(GIBCO), PPARγ forward primer(Macrogen), PPARγ reverse primer(Macrogen), ethanol(Sigma), PCR master mix(TOYOBO)
 
실험방법
1. RNA 추출
1) 실험동물에서 간/지방조직을 적출한다.
2) 간 조직 30 mg(지방조직 200 mg)과 bead를 멸균한 tube에 넣고 RNA extract kit (MN)의 RA1(3.5 μl β-mercaptoethanol 포함)을 350 ul 넣은 뒤, MP homogenize 기계를 이용하여 균질화한다(6 m/s, 40).
3) 균질화된 조직으로부터 RNA extract kit (MN)을 이용하여 total RNA를 분리한다.
4) Nanodrop을 이용하여 추출한 RNA의 순도 및 농도를 확인(μg/μl)한다.
5) 다음 실험 전까지 -80 ℃에 보관한다.
Tips:
- 상세한 방법은 [SOP A13111 RNA 추출 및 cDNA합성] 실험예를 참조한다.
- 260/280 ratio가 1.8~2.1 사이인지 확인한다.
- Base가 증류수이기 때문에 blank를 RNA free 증류수로 잡는다.
 2. cDNA 합성
1) RNA 정량을 바탕으로 total reaction에서의 template RNA 양을 정한다.
2) Oligo dT primer, reverse transcriptase가 들어있는 tube(cDNA PreMix Kit, iNtron)에 추출한 RNA를 넣는다.
Template RNA: 0.1~1 μg
RNA free water: Up to 20 μl
Total reaction volume: 20 μl
3) PCR cycler를 이용하여 cDNA를 합성한다.
- cDNA synthesis, 45 ℃, 60분
- RTase inactivation, 95 ℃, 5분
4) cDNA 합성이 다 끝난 후 원심분리하여 용액을 모은 후 다음 실험 전까지 -20℃에서 보관한다.
Tips:
- TaqMan assay를 이용할 경우, CPT-1에 대한 primer를 이용하여 cDNA를 합성한다.
 3. qRT-PCR
1) cDNA (2 μl), 10 μM forward primer (1 μl), 10 μM reverse primer (1 μl), 2X SYBR Green PCR Master mix (10 μl), RNase-free water (6 μl)를 1.5 ml tube에 넣어 혼합한다.
CPT-1 forward primer: 5’-CACTGCCCTTGGACCCAAATTGCAGG-3’
CPT-1 reverse primer: 5’-AATTTGTGGCCCACCAGGAT-3’
β-Actin forward primer: 5’-AATACCCCAGCCATGTGTGT-3’
β-Actin reverse primer: 5’-ATGGGCACTGTGTGTGACC-3’
Tips:
- 혼합액을 만들 때 삼반복을 위해 3배수 이상의 양을 한 tube에 만든다.
- Normalization을 위해 endogenous control 유전자로 β-Actin을 이용할 수 있다.
- 각 샘플마다 primer를 넣어준 CPT-1 PCR 혼합 tube와 β-Actin primer를 넣어준 PCR 혼합 tube를 만든다.
- Primer sequence는 primer3 등의 web-based primer design 소프트웨어를 이용해서 제작할 수 있다.
2) Real time PCR 전용 plate에 ①에서 혼합한 용액을 넣는다.
3) Real time PCR에 넣고 반응시간에 따라 qRT-PCR를 실시한다. 
4) PCR의 조건은 다음과 같다.
- Incubation: 95℃ 10분
- Amplication: 95℃ 20초,  60℃ 15초, 72℃ 30초 조건으로 총 45 cycles
- Melting curve: 95℃ 15초, 60℃ 1분, 60~95℃에서 0.3℃씩(1초), 95℃ 15초
5) PCR이 끝나고 난 뒤 CPT-1 Ct값을 β-Actin Ct값으로 normalization 한 후, CPT-1 발현양을 확인한다.
Tips:
- 상세한 방법은 [SOP A13112 Quantitative Real Time PCR] 실험예를 참조한다.
실험결과 예
1.  지방조직
2. 간조직



결과해석
간과 지방조직의 CPT-1 mRNA 발현이 고지방식이군에서는 감소한 반면, 항비만소재가 함유된 고지방식이를 공급받은 군에서는 증가하여, 지방산 산화가 촉진될 것으로 해석할 수 잇다.
참고문헌
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